猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法Detecting porcine circovirus 3 with polymerase chain reactionXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：李俊、时建立、彭喆、徐绍建、吴晓燕、刘畅、李琛、孙文博、于江、丛晓燕、韩红、吴家强、杜以军、陈智。5猪圆环病毒3型聚合酶链式反应检测方法1 范围本标准规定了猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus Type 3，PCV3）的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）试验方法。本标准适用于猪圆环病毒3型的快速诊断、检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T 5412016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 原理聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。每完成一个循环需2 min4 min，2 h3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。4 试剂和材料4.1 水：GB/T 6682，一级水。4.2 蛋白酶K溶液（20 mg/mL）：配制见附录A.1。4.3 10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.2。4.4 Tris平衡酚。4.5 三氯甲烷。4.6 无水乙醇。4.7 70 %乙醇：配制见附录A.3。4.8 0.5TBE缓冲液：配制见附录A.4。4.9 电泳级1 %琼脂糖：配制见附录A.5。4.10 DNA核酸染料。4.11 DNA Marker 2000。4.12 引物： P1：5-TACCACAGAAGGCGCTATGTCG-3； P2：5-ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC-3。5 仪器设备5.1 电子天平：感量为0.001 g。5.2 微量移液器（最大量程分别为10 L、20 L、100 L、1 000 L）。5.3 低温高速离心机。5.4 PCR仪。5.5 稳流稳压电泳仪。5.6 水平电泳槽。5.7 凝胶成像系统。6 样品6.1 样品采集按NY/T 5412016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织。6.2 样品处理6.2.1 血清直接用于DNA提取。6.2.2 淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各1 g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1:5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5 000 g离心15 min，取上清液-20 保存备用。7 操作步骤7.1 病毒DNA的提取7.1.1 取上清液（或血清）500 L加入10 %SDS溶液50 L、20 mg/mL蛋白酶K溶液10 L，于55 水浴2 h3 h。7.1.2 加入200 L Tris平衡酚，混匀，4 12 000 g离心15 min7.1.3 取上清液500 L，加入200 L Tris平衡酚和200 L三氯甲烷，4 12 000 g离心15 min。 7.1.4 取上清液400 L，加入200 L三氯甲烷，4 12 000 g离心15 min。7.1.5 取上清液300 L，加入2倍体积的无水乙醇，-20 静置20 min，4 12 000 g离心15 min。7.1.6 弃上清液，加入1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。7.1.7 加入20 L灭菌一级水溶解沉淀，-20 保存备用。7.2 聚合酶链式反应（PCR）操作流程7.2.1 PCR反应体系配制按表1中1-7的循序配制。表1 聚合酶链式反应体系110反应缓冲液5.0 L2dNTP混合液(10 mmol/L)4.0 L表1聚合酶链式反应体系（续）3P1(10 mol/L) 1.0 L4P2(10 mol/L) 1.0 L5DNA4.0 L6TaqDNA聚合酶(8 U/L)1.0 L7灭菌水补足至总体积50.0 L7.2.2 PCR程序设定每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照（用灭菌水作为模板），具体参数见表2。表2 PCR反应程序设定温度时间194 4 min294 20 s350 30 s472 1 min5重复步骤2440个循环672 5 min7.3 电泳操作电压100 V电泳40 min，并在凝胶中加入DNA核酸染料，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。8 结果分析和判定电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现330 bp大小条带，阴性对照孔无特异性条带，则试验成立。在试验成立的条件下，若泳道扩增出大小为330 bp片段判为疑似阳性样品（说明样品中疑似含有猪圆环病毒3型），将目的条带进行序列测定，经序列分析后确认为阳性样品（说明样品中含有猪圆环病毒3型），无特异性扩增的泳道判为阴性。9 试验材料处理9.1 病料的无害化处理对确诊为PCV3阳性的病料应采取深埋、焚烧等方法对病料进行无害化处理。9.2 试验材料处理对于PCR过程的废弃物应放置于专门处置危险废弃物的容器内，通过高压消毒等处理后达到生物学安全标准后才能运出实验室处理。AA附录A （规范性附录）试剂的配制A.1 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶K 100 mg灭菌一级水 5 mLA.2 10 %十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2)十二烷基硫酸钠 10 g灭菌一级水 80 mL浓盐酸 调pH至7.2灭菌一级水 加至100 mLA.3 70 %乙醇无水乙醇 70 mL灭菌一级水 30 mLA.4 0.