生化实验指导.doc

实验一 缓冲溶液的配制和氨基酸两性性质测定一、目的要求1了解缓冲溶液的作用原理及缓冲原理，学习缓冲溶液的设计、配制及酸度计的使用方法。2观察甘氨酸的两性性质和缓冲作用。二、实验原理能抵抗一定量酸或碱的影响，而保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。缓冲液一般是由弱酸或弱碱与它的盐组成。如乙酸和乙酸钠组成乙酸缓冲液、硼酸和硼砂组成硼酸缓冲液等。缓冲液可分为一般缓冲液(或通用缓冲液)和标准缓冲液两类。标准缓冲液pH值是一定的(与温度有关)，叫做pH标准液，当用酸度计测量溶液的pH值时，就要用pH标准液来校正仪器。一般缓冲液的pH值可用下式计算： 式中的Ca、Cb、Cs分别为弱酸、弱碱、盐的浓度(mol/L)；Ka、Kb分别为弱酸、弱碱的电离常数；Kw为水的离子积。当温度一定时，pKa(或pKb)为一常数，因此缓冲液pH值就随着盐和酸(或碱)的浓度比值而变化。如果制备缓冲液时所用的盐和酸的浓度相同，则配制时所取盐和酸的溶液的体积比就等于它们的浓度比，故上式可写为：可见只要按盐和酸溶液的毫升数的不同比值配制就可得到不同pH值的缓冲液。如加水稀释，其盐和酸的浓度都以相同比例降低，比值不变，因此适量稀释不影响缓冲液的pH值。缓冲液能抵抗一定量酸或碱的作用称缓冲作用，缓冲作用的大小称为缓冲能力或缓冲容量()，可定义为每升缓冲液改变一单位pH值所需加入强碱或强酸的量(摩尔数)。一种特殊的酸和它相配对的碱在它们浓度相等(即pH值等于酸的pKa)时，缓冲能力最大。缓冲能力除与其共轭酸碱对的比率有关外，还与总浓度有关，总浓度越大，缓冲能力越强，一般缓冲液浓度在0.050.20mol/L，pH=pKa1的范围内具有满意的缓冲能力。氨基酸是一类两性物质；既可以和酸作用，又可以和碱作用，对酸、碱的加入具有一定的缓冲能力；通过甘氨酸的酸、碱滴定及测量不同浓度的酸、碱条件下甘氨酸溶液的pH值，绘出条滴定曲线，从中可以看到这种变化。三、仪器及器材酸度计，碱式滴定管，移液管，三角瓶，容量瓶，烧杯四、试剂10.1 mol/L，0.01mol/L NaOH20.1molL，0.01 mol/L HCl30.1%溴麝香草酚蓝溶液4Na2HPO42H2O (化学纯)5KH2HPO4 (化学纯)60.1 mol/L甘氨酸溶液五、操作方法1磷酸缓冲液的配制及pH值的测定：（1）母液的配制：A液（0.1mol/L KH2PO4）：称量1.36g KH2PO4定溶100mL。B液（0.1mol/L Na2HPO4 ）：称量3.58g Na2HPO4定溶100mL。（2）不同pH值的磷酸缓冲液的配制：取三个50mL的三角瓶，编号，按表1-1操作：表1-1 磷酸缓冲液pH值的测定试剂（mL）三角瓶号1 2 30.1mol/L KH2PO424 15 60.1mol/L Na2HPO46 15 24pH 计测定结果计算结果混匀后用酸度计测定三种缓冲液的pH值，并填入表1。2稀释对缓冲液pH值的影响：取2个三角瓶，编号，按表1-2操作；表1-2 稀释对缓冲液pH值的影响试剂（mL）三角瓶号4 50.1mol/L KH2PO415 7.50.1mol/L Na2HPO415 7.5蒸馏水0 15指示剂显色（3滴）淡蓝 淡蓝pH 计测定结果混匀后分别在各管中加入3滴麝香草酚蓝指示剂，比较试管溶液的颜色，并用酸度汁测定4、5号三角瓶中的pH值，填入表2。3不同浓度的缓冲液缓冲能力的测定：取2个三角瓶，编号，按表1-3操作；表1-3 不同浓度的缓冲液缓冲能力的测定试剂（mL）三角瓶号6 70.1mol/L KH2PO40.6 60.1mol/L Na2HPO42.4 24蒸馏水27 0总浓度0.01mol/L 0.1mol/L指示剂显色（3滴）浅蓝 浅蓝pH计测定结果用HCl滴定(刚变色)消耗的量(用0.01 mol/L HCl滴定) (用0.1 mol/L HCl滴定)pH计测定结果计算结果测定滴定前和滴定后6、7号三角瓶中的pH值，并填入表3。4测定甘氨酸的滴定曲线 取50mL三角瓶15个，编号，按表1-4数据加入试剂，充分摇匀后分别测定pH值。表1-4 甘氨酸的滴定曲线的测定1234567891011121314150.1mol/L甘氨酸溶液（mL）5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.00.1molLHCl（mL）0.00.51.02.02.53.04.05.00.1 mol/LNaOH（mL）0.51.02.02.53.04.05.0蒸馏水（mL）15.014.514.013.012.512.011.010.014.514.013.012.512.011.010.0pH六、数据处理及结果分析1. 缓冲液pH值的计算：按下列公式计算三角瓶1、2、3中溶液的pH值(KH2PO4的pKa=6.81)，并填入表1。pH=pKa+lgKs/Ka2. 缓冲能力的计算按公式计算三角瓶6、7中的缓冲能力的大小，并填入表3。db/d(pH)3. 绘制甘氨酸的酸碱滴定曲线：以表四测定的pH值为纵坐标，以HCl、NaOH的毫升数为横坐标，绘制甘氨酸的酸碱滴定曲线。七、注意事项1缓冲液的pH值必须准确。2了解pH计的正确使用方法，注意电极的保护。八、思考题1试述缓冲液的作用及决定缓冲能力大小的因素。2在实际应用中应如何正确选用和配制符合要求的缓冲液？3在甘氨酸的酸碱滴定曲线上，哪些部分代表缓冲区域？何处为等电点？九、参考文献1陈雅蕙 等编.生物化学实验原理和方法（第2版），北京大学出版社，2005，p449-4572陈毓茎 主编.生物化学实验方法和技术（第1版），科学出版社，2002，p217-227附：常见缓冲液及其优缺点：1. 磷酸盐缓冲液磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2个pKa 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽：NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21Na2HP04：pKa2=7.21, pKa3=12.32配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 14 。配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 68。配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 1012 。磷酸盐缓冲液的优点为：容易配制成各种浓度的缓冲液; 适用的 pH 范围宽; pH 受温度的影响小;缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。其缺点为：易与常见Ca2+、Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀; 会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。2.Tris缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷) Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在“中性”范围 , 例如 Tris-HCl 缓冲液pH 值为 7.58.5，Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.09.0。Tris-HCl 缓冲液的优点是： 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性的大范围 pH 值的缓冲液; 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。其缺点是：缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释10倍, pH 值的变化大于0.1; 温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于04; 易吸收空气中的CO2, 所以配制的缓冲液要盖严密封;此缓冲液对某些 pH电极发生一定的干扰作用, 所以要使用Tris 溶液具有兼容性的电极。3. 硼酸盐缓冲液常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.510.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。4. 氨基酸缓冲液此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.011.0, 例如最常用的有：甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.05.0 ；甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.011.0 ；甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.011.0(此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液) 。组氨酸缓冲液：pH 值为 5.56.5 。甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.88.8 。甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 缓冲液：pH 值为 8.09.0 。此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过程等; 试剂的价格较高。实验二 分光光度计线性分辨范围测定一、目的要求掌握比色法的用途、原理、测定分光光度计线性范围的方法及重要性。二、实验原理比色法是常用的生化分析方法。仪器简单，价格便宜，操作方便。有分光光度计的实验室，可以很方便地完成多种生物物质的定量分析。比色法的理论基础是朗伯比尔吸收定律，它的使用要求在分光光度计线性分辨范围之内，否则将使结果出现较大的误差，这一点恰恰是容易被忽视的。通过对一台分光光度计线性分辨范围的测定，加深对比色法的理解，对今后的科学研究也将是十分有益的。在用紫外可见分光光度计进行某种物质溶液的吸收光谱测定之前，先将光源灯发射的连续光谱分光获得一定波长的单色光，然后测定单色光透过溶液的吸光度，所以比色法也称为分光光度法。各种不同的物质具有其各自的吸收光谱，因此当某种光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能减弱的程度和光经过的物质的厚度及物质的浓度有一定的比例关系。A= lgI0/I =lg1/T=bC式中I0为入射光强度，I为透射光强度，b为溶液厚度，C为溶液浓度，T为透光度，TI / I，A为吸光度，为摩尔吸收系数。如果溶液浓度以molL表示，溶液厚度以cm表示，单位为L(molcm)。愈大，表示溶液对单色光的吸收能力愈强，分光光度测定的灵敏度就愈高。这就是在分光光度测定中常用的朗伯比尔定律。该定律表示入射光通过溶液时，吸光度与该溶液的浓度和厚度的关系。根据朗伯比尔定律，吸光度与溶液浓度应是通过原点的线性关系(溶液厚度一定)，但在实际工作中吸光度与溶液浓度之间常常偏离线性关系，产生偏离的主要因素有：1样品溶液因素。朗伯比尔定律通常只在稀溶液时才能成立，这是由于随着溶液浓度增大，吸光质点间距缩小，彼此间相互影响和相互作用加强，破坏了吸光度与浓度之间的线性关系。2仪器因素。朗伯比尔定律只适用于单色光，但经仪器狭缝投射到被测溶液的光，并不能保证理论要求的单色光，这也是造成偏离朗伯比尔定律的一个重要因素。在仪器确定的情况下，着重考察溶液浓度变化对吸光度线性的影响。三、仪器及器材紫外可见分光光度计，试管，试管架，容量瓶， 烧杯，吸管，玻璃棒1根四、试剂牛血清白蛋白溶液(1mg/mL)：称取牛血清白蛋白(BSA)500mg，用少量水溶解后定容至500 mL。五、操作方法1含量为100500g/mL牛血清白蛋白的光吸收情况取6支试管，按表2-1操作，以第1管为空白对照，测定各管的吸光度。表2-1 100500g/mL牛血清白蛋白的光吸收的测定试管号1234561mg/mL的牛血清白蛋白（mL）00.51.01.52.02.5蒸馏水（mL）54.543.532.5牛血清白蛋白的含量（g/mL）0100200300400500A2802含量为0.10.5g/mL牛血清白蛋白的光吸收情况（1）样品稀释取l00mL容量瓶1只，准确加入0.1mL浓度为lmg/mL的牛血清白蛋白溶液，加水稀释至刻度，为1g/mL牛血清白蛋白稀释液。（2）按下表操作，以第1管为空白对照，测定各管的吸光度。表2-2 0.10.5g/mL牛血清白蛋白的光吸收的测定试管号1234561g/mL的牛血清白蛋白（mL）00.51.01.52.02.5蒸馏水（mL）54.543.532.5牛血清白蛋白的含量（g/mL）00.10.20.30.40.5A280六、数据处理及分析在坐标纸上以牛血清白蛋白含量(g/mL)为横座标，以相应各管吸光度为纵座标，分别绘制分光光度计线性分辨范围曲线，并对结果进行分析，找出牛血清白蛋白含量的线性范围。七、注意事项1溶解牛血清白蛋白时不可剧烈搅拌，避免产生泡沫。2分光光度计用氘灯，比色时用石英杯。八、思考题1适于光谱分析的溶剂应具备哪些性质?2在用分光光度计做比色测定时，如何选择波长和狭缝?3为减少比色的相对误差，吸光度应控制在什么范围?九、参考文献1陈雅蕙 等编.生物化学实验原理和方法（第2版），北京大学出版社，2005，p178-1882陈毓茎 主编.生物化学实验方法和技术（第1版），科学出版社，2002，p73-76实验十 酵母RNA的分离及组分鉴定一、目的学习核酸的制备方法，了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、原理酵母中富含核酸，主要是RNA(约占干重3-10%)，DNA则很少，酵母RNA提取过程是先使RNA从酵母细胞中释放出来，并把它和蛋白质分离。RNA与蛋白质的分离是采用稀碱溶液溶解法，再离心使之与菌体蛋白分离。由于DNA在稀碱溶液中较稳定，因而DNA随菌体蛋白一起弃去，使得DNA和RNA分离。然后利用核酸在酸性乙醇中不溶解的性质，使RNA沉淀下来。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。三、器材量筒(100mL)、烧杯(100mL)、锥形瓶(100mL)、抽滤瓶、布氏漏斗、移液管(1mL、2mL)、滴管、玻璃、离心机、离心管(80mL)、试管及试管夹、水浴锅、台秤、天平、石蕊试纸等。四、试剂1干酵母粉或新鲜酵母(市售)20.2%氢氧化钠溶液：2g NaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL 310%硫酸：量取10mL浓硫酸(比重1.84)缓缓倒人86mL蒸馏水中495%乙醇5无水乙醚6氨水7乙酸85%硝酸银溶液：5g AgNO3溶于蒸馏水并稀释至100mL，贮于棕色瓶9钼酸铵试剂：29.0g钼酸铵溶于3N 400mL的硝酸溶液中10苔黑酚一三氯化铁试剂：将100mL浓盐酸中，再加入100mgFCl3.6H2O(临用时配制)。五、操作方法（一）RNA的提取：取5g干酵母粉（或25g新鲜酵母）于250mL烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40mL，沸水浴30min并经常搅拌，冷却后转移到离心管中，以4000 rmin离心15min，将上清液倾人100mL烧杯中，加入醋酸数滴，使提取液pH为2.5，边搅拌边加入95%乙醇30mL，加毕静置10min使沉淀完全，然后转移至离心管中以4000rmin离心10min。弃去上清液，将离心管底部的沉淀用95%乙醇约20mL充分搅拌洗涤，并转移至布氏漏斗中抽滤，再用95%乙醇和乙醚(各约20mL)分别淋洗，所得的滤渣即为粗RNA制品。将制得的RNA制品在滤纸上风干，称重。（二）RNA的鉴定：取约0.2g RNA制品放人试管中，加入10%硫酸5mL，在沸水浴中加热10-20min，边加热边摇动，得RNA水解液，然后取3支试管按下述方法进行组分的鉴定：1. 嘌呤碱：取水解液2mL，加入浓氨水2mL，再加入5%AgN03溶液1mL，观察有无白色絮状嘌呤银化物出现。2. 核糖：取水解液0.5mL，加入苔黑酚一三氯化铁试剂1mL，置沸水浴中加热片刻，注意观察溶液是否变成鲜绿色。3. 磷酸：取水解液2 mL，加入钼酸铵试剂2mL，观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀出现。六、实验结果及分析七、注意事项RNA提取的关键操作是用乙醇洗涤离心管中的沉淀时，搅拌要充分。RNA进行酸水解时，最后得到的水解液要澄清，如有沉渣，最好进行过滤。八、思考题1工业上制备RNA有几种方法，制备的原理是什么？2本实验中为什么加入乙醇，作用如何？实验十二 紫外吸收法测定核酸的含量一、目的要求1. 通过实验，了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。2. 进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（CC一CC一），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以（）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。在pH=7.0时两种核酸的消光系数及相关数值如表。表12 核酸摩尔消光系数及相关数值(P)pH7，260nm含磷量/(%)A260nm1g/mlRNA7700-78009.50.024DNA-Na盐（小牛胸腺）66009.20.020 采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1g/mL的DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1g/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度A260nm，即可计算测出其中核酸的含量。蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3gmL的含量即可测出。三、实验材料和器材1测试材料样品RNA或DNA干粉。2器材电子分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，冰浴，容量瓶（50ml），移液管，试管及试管架。四、实验试剂1钼酸铵过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵2.5%过氯酸溶液。25-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。五、操作步骤1准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%6%氨水调至pH7，定容到50mL。2取两支离心管，甲管内加入2mL 样品溶液和2mL 蒸馏水；乙管内加入2mL 样品溶液和2mL 沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min 离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL 上清液，用蒸馏水定容至50mL。选用光程为1cm 的石英比色杯，在260nm 、280nm波长下测其光密度。如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（2050g/mL）在紫外分光光度计上直接测定。六、数据处理1计算核酸的浓度（g/mL）式中，为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值。N为稀释倍数，L为比色皿的光径。在计算纯净的样品时，A260直接换成纯样品的A260即可。2计算A260和A280的吸收比值七、分析讨论八、思考题：1干扰本实验的物质有哪些？2若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？实验三十二 绿豆超氧物歧化酶的提取一、目的：本实验通过对绿豆中SOD的分离，掌握从细胞中抽提酶的原理和方法。二、原理超氧化物歧化酶(superoxidc dismutase，简称SOD，EC 1.15.1.1)是广泛存在于动物、植物和微生物中的金属酶，它的功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧：SOD作为一种重要的抗氧化剂，它对于维持生物体内自由基的产生和清除之间的平衡起着重要的作用。在某些病理情况下，自由基产生和清除功能失去了平衡，不论其原因是自由基产生过量，还是不足，或者是机体清除自由基的能力减弱，都会导致疾病的发生或衰老。目前人们已开始研究它在治疗放射病以及抗炎症和抗衰老等方面的临床应用。SOD在生物体内是一组同工酶，按照SOD活性中心所含的金属离子不同，SOD可分为CuZn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD三种。这三种酶活性部位的金属离子与酶蛋白都在催化反应中起到关键作用，但它们的性质与分子结构有所不同。FeSOD和MnSOD的一级结构和空间结构很相似，但均不同于CuZnSOD的结构。CuZnSOD一般是由两个相同的亚基组成二聚体，每个亚基的相对分子质量约为16000，含一个铜原子及一个锌原子。不同来源的CuZnSOD的氨基酸序列，无论是来自细菌、真菌、高等植物细胞浆或叶绿体，还是来自高等动物和人的细胞浆，它们的同源性都很高。MnSOD在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体，大多数FeSOD为二聚体。这两种SOD的许多性质都很相似，每个亚基的相对分子质量一般为23000，每个亚基含有0.51.0个Mn或Fe原子。任何生物来源的FeSOD和MnSOD的一级结构的同源性都很高。CuZnSOD存在于动、植物的细胞质和植物的叶绿体以及某些原核生物中；MnSOD存在于真核生物的线粒体和许多原核生物中，FeSOD则主要在需氧的原核生物中及植物的叶绿体中存在。由于SOD是存在于植物细胞内的蛋白质，因而在从植物中分离提取SOD时需要首先破碎细胞，然后进行抽提，三种SOD都可以得到。所谓抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解在适当的溶剂中，通过离心分离，可以得到无细胞抽提液。本实验所用的材料为浸泡萌动的绿豆种子，用高速组织捣碎，用pH7.8的磷酸缓冲液为抽提液，绿豆中的SOD可以在此溶剂中被抽提出来，离心可以获得酶的粗提液。三 实验材料与器材1实验材料：当年的绿豆种子。2器材：高速组织捣碎机；纱布；冰冻离心机；50mL离心管；2个500mL 烧杯。四、试剂50mmol/L pH7.8磷酸盐缓冲液。五、操作方法1材料培养称取100g绿豆，浸于500mL水中，于27约24小时，使绿豆胀大一倍左右。2细胞的破碎和酶的浸提将浸泡的绿豆中的水倒掉，加入预冷的0.5L 50mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液用高速组织捣碎机捣碎，在冰箱的冷藏室内浸泡1h。 3过滤用4层纱布挤压过滤，滤液置于烧杯中。4离心处理用冷冻离心机离心，在4条件下，10000 rmin离心25min。小心倾出上清液即为粗酶提取液。5记录粗酶液体积，将酶液保存在20的冰箱中。在实验 中测定其蛋白质的含量和酶的活性。六、思考题：1本实验为什么选用pH7.8的缓冲液来提取SOD?八、参考文献1.邱广亮,李咏兰,石晶瑜,栗淑媛.绿豆胚超氧化物歧化酶的纯化及性质研究.精细化工,2000,17:57-59实验三十三 硫酸铵沉降法纯化SOD一、目的使学生掌握盐析和透析方法进行蛋白质分离纯化的原理和方法。二、原理球状蛋白质在较低的离子强度范围内，随着离子强度的增加蛋白质的溶解度增大。这种现象叫盐溶。在较高的高子强度范围内，随着离子强度的增加，球状蛋白质的溶解度减少，当离子强度达到足够大时，球状蛋白质便从溶液中完全沉淀。这种现象叫盐析。硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁以及氯化钠等中性盐都可以作为蛋白质的沉淀剂。但是，最常用的中性盐是硫酸铵。因为硫酸铵在水中最稳定，溶解度较大。它是最温和的试剂，提纯蛋白质时，即使硫酸铵的浓度高，也不会引起蛋白质的变性。硫酸铵等中性盐是脱水剂，在一定的盐浓度下，能除去蛋白分子表面的水化层，使蛋白质从溶液中沉淀下来，不同蛋白质由于水化层厚度不同，需要用不同浓度的硫酸铵才能分别沉淀。因而，控制硫酸铵的浓度，就可以使所需蛋白质与其它蛋白质分离开来。通常在实验中硫酸铵浓度不用摩尔浓度而用饱和度表示，这是因为固体硫酸铵加入水中后出现相当大的非线性的体积变化。使摩尔浓度的计算非常麻烦，所以，硫酸铵浓度不用摩尔浓度表示。用饱和度表示硫酸铵浓度，应用起来十分方便。从硫酸铵饱和度计算表中可以查出，一升溶液需要加入的硫酸铵的克数。研究表明，绿豆粗抽液中的SOD在35%65%饱和度的硫酸铵中沉淀量最大。因而首先用35%饱和度的硫酸铵沉淀除去杂蛋白，离心后，对上清液再用65%饱和度硫酸铵沉淀，此沉淀中含有大量的SOD。盐析法有下列优点：1不需要特殊设备，方法简单，可以大量制备蛋白质；2一般分离效果较好，一步可以提纯4倍；3可以使蛋白质溶液浓缩，为高分辨力的层析法提供方便。盐析法缺点是：1必须透析除盐，透析时间很长，易使蛋白质变性；2分离区间较大，对溶解度接近的两种蛋白质不易分开，即发生共沉现象。用硫酸铵沉淀蛋白质，如果不除去无机盐，就无法用电泳法，离子交换层析法作进一步分离提纯，也影响酶活力的测定，因此，必须除去无机盐。用透析法、超滤法和分子筛层析的方法可以从蛋白质制剂中除去无机盐。透析是利用蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质能通过半透膜的性质，使蛋白质和小分子杂质分开的方法。常用的半透膜是玻璃纸、火棉胶薄膜等。将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，然后将透析袋放在蒸馏水或低离子强度的缓冲液中，则小分子杂质通过半透膜而被除去，大分子蛋白质则仍留在袋中。为了缩短透析时间，可以经常换水或流水透析。用4%BaCl2溶液检查透析袋外的溶液是否含有硫酸根离子，当液体中无BaSO4白色浑浊出现时，即表明硫酸铵已被除尽，可以结束透析。（NH4）2 SO4+BaCl2BaSO4+2NH4Cl三 仪器和器材冰冻离心机；磁力搅拌器；离心管：50mL；烧杯：500mL；透析袋；透析夹；移液管：2mL；吸耳球；试管。四、试剂150mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液；24%BaCl23硫酸铵。五、操作方法135%饱和度的硫酸铵沉淀除去杂蛋白准确计量酶粗提液体积，计算35%硫酸铵饱和度所需的硫酸铵的用量(0条件下每100mL溶液中加入固体硫酸铵19.4g)，在磁力搅拌下慢慢加入硫酸铵，以沉淀非SOD的蛋白质，4静置20min，10000rmin离心10分钟后取出上清液。265%饱和度硫酸铵沉淀SOD上清液再加入硫酸铵，使达到65%饱和(0条件下每100mL溶液中再加入固体硫酸铵18.4g)，10000rmin离心10分钟后保留含有SOD的沉淀。3透析除盐将沉淀溶于少量缓冲液中(以沉淀刚溶解为度)，装入透析袋中，于4条件下透析24小时，除去硫酸铵，透析液为20 mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液。透析后离心10min弃去沉淀。4纯化后酶液的处理计量酶液的体积，保留上清液1mL于冰箱中。其余保存在冰箱中供进一步纯化用。六、注意事项加入的硫酸铵一定要全部溶解，透析液最好选用为20 mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液，透析时要在4条件下。七、思考题1在蛋白质分离纯化时常常选用硫酸铵沉淀的方法，说明原因。2本实验中为什么选用20 mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液作为透析液？八、参考文献1.邱广亮,李咏兰,石晶瑜,栗淑媛.绿豆胚超氧化物歧化酶的纯化及性质研究.精细化工,2000,17:57-592.张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验技术方法和技术（第2版），高等教育出版社，1997，p217-222实验三十四 葡聚糖凝胶层析脱盐一、目的1学习凝胶层析的工作原理和操作方法。2掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。二、原理凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。1凝胶层析介质的特点凝胶层析介质有多种，目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶(商品名称Sephadex)是最常用的层析介质。各种凝胶层析介质虽然化学组成和结构不同，但都有如下的特点：遇水为不溶解的固相；是化学惰性物质；离子基团含量少；颗粒大小和网眼均匀；机械强度较强；具有可选择的多种孔径。葡聚糖凝胶是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1氯2，3环氧丙烷交联成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同、型号各异的凝胶。葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小。葡聚糖凝胶（Sephadex）不溶于水，但分子中含有大量的羟基，因而极性很强，易吸水膨胀，其吸水量与交联度成反比。在Sephadex后面缀上G-X作为交联度的标记。交联度越小，吸水量越大，X值越大。实际上X值约为该胶粒吸水量的10倍。例如：Sephadex G-50和G-100，吸水量分别为5mL/g凝胶与10mLg凝胶。此外交联度大，机械强度大，较能耐受较高压力，易采用高流速；而交联度小的如Sephadex G-150和G-200，则机械强度小，易被压缩，使用时流速需慢些。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定。2凝胶层析的分离原理当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进人凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着洗脱液在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱(此现象叫做被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限)；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。我们用多个试管分别收集洗脱液，就可以将混合物中各组分彼此分离开来。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，为了进一步分离纯化的需要，常常需要进行蛋白质的脱盐工作。可采用层析介质为葡聚糖凝胶G25(或G15、G50)，用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。三、实验材料及设备1，材料硫酸铵沉降法得到的SOD溶液。2器材层析柱：1.0cm25cm(内径柱高)；烧杯：250mLl,50mL1；滴定台架、螺丝夹：各1；离心管：5mLl；刻度试管：10mL20；滴管：2；移液管：lmLl；玻棒：1。四、试剂的配制1BaCl2溶液(4%)2考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL 95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。3脲(6molL)4洗脱剂：1%NaCl溶液。五、操作步骤1葡聚糖凝胶G-50(或G-15、G-25)的处理将4g葡聚糖凝胶G25放置烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2h或在室温下溶胀6h以上。除去上层漂浮的细碎凝胶，重复34次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。2层析柱的准备(1)清洗：每组取一支层析柱，清洗干净。(2)装柱：取层析柱，垂直固定于铁架台上，在下口连接带有滴嘴的乳胶管。层析柱中注入洗脱液（要防止下端出口窝藏气泡），夹上螺旋止水夹。将溶胀的凝胶沉淀与水的体积之比调整为约为2：l。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度约柱高的2/3为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干裂和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。3平衡取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约34cm高水位。关闭出水口。此时，胶床高度15cm为宜。4准备收集管取21只干净的刻度试管，17编号，排成三排，第一排准备收集洗脱液，每管收集2mL。5上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用移液枪将0.5mL盐析样品溶液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入lcm高水位，然后排液至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入34cm高的洗脱剂。开始收集1号管。每管收集洗脱液2mL。6洗脱不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位34cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到7号管达2mL时，关闭出口。7蛋白质的鉴定分别从每管2mL的收集液中取0.4mL于对应的后两排试管中，一支管中加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。另一支管加lmL考马斯亮蓝G250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。如果鉴定的第7号管中，仍有样品(蛋白质或SO42-)，表明洗脱和收集未完，需增加试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。8凝胶再生鉴定完毕，打开出水口，继续用23倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口。以备下次使用。长时间不同或者用的次数过多，凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染杂质过多，甚至变色，则需要对凝胶进行再生处理，即把凝胶倒出，用6molL脲浸泡凝胶0.5h，抽滤，再用水漂洗数次，加入几滴氯仿，摇匀存放在冰箱的冷藏室内保存。六、结果处理1绘制洗脱曲线根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，颜色深浅程度为纵坐标，绘制样品洗脱曲线。2根据洗脱曲线分析分离效果。七、思考题1利用凝胶层析分离混合物时，应该怎样选择凝胶的类型？2凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果?八、参考文献1.邱广亮,李咏兰,石晶瑜,栗淑媛.绿豆胚超氧化物歧化酶的纯化及性质研究.精细化工,2000,17:57-592.张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验技术方法和技术（第2版），高等教育出版社，1997，p217-222实验十六 考马斯亮兰法测定蛋白质的含量（Bradford法）一、目的要求掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理和方法。二、实验原理1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。三、实验器材可见光分光光度计、旋涡混合器、试管10支四、试剂1标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成lmg2蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（Wv）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（WV）乙醇，和8.5%（wV）磷酸。五、操作方法1标准曲线和样品的测定：取9支试管，1支作空白，3支留作未知样品，按下表分别加入样品、水和试剂，最后各试管中分别加入4.0mL考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。2比色：加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管。表16 蛋白质标准曲线和蛋白质含量的测定管号123456789100g/mL标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）样液（mL）蛋白质含量（g）加入蛋白试剂（mL）光吸收值（A595）01.0040.20.82040.40.64040.60.46040.80.28041.0010041.01.01.0六、数据处理和分析1标准曲线的制作用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。2蛋白质含量的确定记录各样品的光吸收值，在标准曲线上查得对应的蛋白质的含量，计算出各提取阶段所得液体中蛋白质的总含量。七、注意事项不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。八、参考文献1Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, p55-592蔡武成、袁厚积主编：生物物质常用化学分析法，1982，p93993张龙翔、张庭芳、李令媛等编著，生化实验方法和技术，高等教育出版社，1981，p164169 实验六 用阳离子交换树脂摄取氯化钠一、目的要求通过用阳离子交换树脂摄取氯化钠的实验，学习离子交换层析法的原理和基本操作技术。二、实验原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换树脂是一种带有离子的不溶于水的分子聚合物。离子基团又称活性基团，因它与母体的亲合程度不同，故能与溶液中的离子进行交换，而树脂本身的物理性能不变。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有