微生物学实验教程

、微生物学实验室常用的器皿微生物学实验室所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不致破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。本节将对这几方面作详细介绍。一、器皿的种类、要求与应用1试管（test tube）微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口（图-1，A），不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管（图-1，B）而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管帽（图-1，C），若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需使用螺口试管（图-1，D），盖以螺口胶木或塑料帽。试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号。（1）大试管（约18180mm）可盛倒培养皿用的培养基；亦可作制备琼脂斜面用（需要大量菌体时用）。（2）中试管（约1315100150mm）盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的稀释和血清学试验。高等医学院校实验教材 医学微生物与免疫学 实验指导 主 编 韩 莉 副主编 张昌菊 宋利琼 编 者 (以姓氏笔画为序) 王 磊 朱 平 刘 嘉 刘 英 宋利琼 吴红艳 杨建林 周永芹 张 颖 张昌菊 韩 莉 三峡大学医学院生物病原部 2005年6月29日 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.31 目 录 第一篇 医学微生物学 实验室规则 2 实验一 常见细菌形态学检查方法(综合性实验)3 实验二 细菌的分离培养法与消毒灭菌(综合性实验) 11 实验三 化脓性球菌的分离鉴定(设计性实验) 27 实验四 肠道杆菌的分离鉴定(设计性实验) 32 实验五 厌氧菌,分支杆菌的检查法(综合性实验) 41 实验六 各种微生物形态,病毒学检查法(综合性实验) 46 微生物学各论自学提纲 56 第二篇 医学免疫学 实验一 天然免疫功能的检测(综合性实验) 60 实验二 常见抗原抗体反应(综合性实验) 67 实验三 细胞免疫检测I:细胞因子的检测(设计性实验)86 实验四 细胞免疫检测:淋巴细胞分离,计数及活性检测(设计性实验)94 实验五 细胞免疫检测III:淋巴细胞增殖实验(设计性实验)103 综合复习 107 附录 113 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.32 实验一,常见细菌形态学检查方法 (综合性实验) 【实验内容】 一,细菌涂片制作及革兰氏染色法. 二,细菌的基本形态与特殊结构观察. 三,细菌动力的观察(悬滴法). 四,显微镜油镜的使用和维护. 五,电镜观察细菌的菌毛. 【目的要求】 一,初步掌握细菌涂片制作过程及革兰染色的操作技术. 二,认识细菌基本形态. 三,了解细菌特殊结构及其与医学实践关系. 四,初步掌握油镜的使用和维护. 五,了解电镜在医学微生物学研究中的应用. 【实验原理】 一,革兰染色法 细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术.由于细菌个体微小,无色半透明,在普通光学显微镜下不易清晰观察,一般需经染色来增加反差,从而有利于对细菌标本的观察.染料有带阴离子着色基团的酸性染料和带阳离子着色基团的碱性染料.在一般生理条件下(pH 7.4左右),细菌菌体都带负电荷,故用于细菌染色的染料多为带阳离子着色基团的苯胺染料,如美蓝,结晶紫,碱性复红等,它们较易与细菌菌体结合. 染色方法可分单染色法和复染色法两大类.前者只用一种染料染色,只能观察细菌的形态和排列,不能显示细菌结构及染色反应性;后者是以两种以上的染料染色,可显示出细菌的特殊结构或染色反应性能,在细菌的鉴别上有一定意义,其中最常用的为革兰染色法. 细菌革兰(Gram)染色是最常用的细菌鉴别染色法,首先由Gram创用而得名.细菌染色后不仅可区别其形态和排列方式,还可根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类;不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌(G+菌),被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌(G-菌).革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别,同时还为分析细菌的致病性Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.33 和选用抗菌药物提供了依据. 革兰染色的原理目前存在三种假说: 1.通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易透入;革兰阴性菌细胞壁结构疏松,肽聚糖层薄,含大量脂质,乙醇易渗入. 2.等电点学说 革兰阳性菌等电点(pI 23)比革兰阴性菌(pI 45)低,在相同pH条件下,革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多,故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易脱色. 3.化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐,可与碘,结晶紫牢固结合,使已着色的细菌不被乙醇脱色;革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少,故易被脱色. 在细菌标本染色前,必须将细菌固定在载玻片上,常用的固定方法为加热法,其目的是杀死细菌,且保持原有形态,并使细菌粘附在载玻片上,不致染色时脱落. 二,细菌的基本形态和特殊结构观察 细菌形体微小,且为无色半透明,必须经过适当的染色,经显微镜(如图1)放大1000倍才能观察清楚,故须用油镜观察. 使用油镜时,要在标本上滴加香柏油,其目的是增加进入透镜的光线,使视野明亮度加强,物象才看的清楚.原理为:透镜的孔径小,进入的光线先通过标本玻片,再通过透镜与油镜头之间的空气,然后进入油镜头.由于玻片与空气折射率不同,光线通过两种折射率不同的介质,就会发生折射(如图2),以至进入油镜头的光线不够强,致使物象不清晰.当油镜头与玻片之间加香柏油后,由于香柏油的折射率(1.515)和玻璃的折射率(1.52)相仿,因此,进入透镜的光线增加了(如图2).视野明亮度加强,物象也就看得清楚了. 目镜 物镜转换物镜 标本推进载物台 光圈 集光器 反光镜 镜座 标本推进器旋细调节轮 粗调节轮 镜臂 图1 普通光学显微镜的结构 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.34 细菌的基本形态可分为球菌,杆菌和螺形菌三类.球菌按其分裂繁殖方向与分裂后排列情况又分为双球菌,链球菌,四联球菌,八叠球菌,葡萄球菌等;杆菌也有球杆菌,链杆菌,分枝杆菌,棒状杆菌等之分;螺形菌中菌体仅有一个弯曲,呈逗点状者叫弧菌,菌体有23个弯曲,且较僵硬者为螺菌.某些细菌除了有细胞壁,细胞膜,细胞浆和核质这些基本结构外,还具有其他特殊结构,包括荚膜,鞭毛,菌毛和芽孢.这些特殊结构有着各自的不同意义. 三,细菌动力的观察(悬滴法) 许多杆菌,弧菌具有鞭毛,有动力,在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地方.一般球菌无鞭毛,没有动力,但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的颤动. 四,电镜观察细菌的菌毛 电子显微镜是根据电子光学原理,用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜,使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器. 电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示.20世纪70年代,透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米).现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍,而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍,所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子. 【实验材料与仪器】 一,无菌牙签,革兰染色液(结晶紫染液,碘液,95%酒精,复红染液),生理盐水,载玻片,冲洗用具等 二,普通光学显微镜,香柏油,二甲苯,擦镜纸 玻片透镜 香柏油 图-2 油镜的原理 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.35 三,球菌,杆菌,螺形菌及特殊结构示教片 四,葡萄球菌,变形杆菌幼龄(812小时)肉汤培养物,凹玻片,盖玻片, 凡士林等 五,电镜H-7500,放大倍数2060万倍,最大分辨能力0.204 nm 【实验方法与步骤】 一,细菌涂片制作及革兰氏染色法 1.制片: 涂片:取清洁玻片一张,在玻片的中央滴一小滴生理盐水(滴加生理盐水不宜过多).用无菌牙签挑取牙垢少许,与玻片上的水滴混匀,涂布成一厘米大小的均匀薄膜. 干燥:将涂片放室温中自然干燥,切勿紧靠火焰烘烤,以免标本烤焦,损害菌体结构. 固定:持玻片一端,标本面向上,迅速通过火焰三次(约23秒),以玻片温度达到皮肤能耐受的温度为宜.固定的目的是杀死细菌,使其固定于玻片上,并能增强细菌对染料的通透性. 2.革兰染色: 初染:将已固定的涂片标本,加结晶紫染液于涂面上染色1 min,然后水洗. 媒染:加革兰氏碘液媒染1 min,水洗. 脱色:滴加95%酒精,频频摇动载玻片,斜持载玻片,使脱下的染液流下,再次滴加酒精脱色,直至流下酒精无色或稍呈淡紫色为止,水洗. 复染:用稀释复红或沙黄染液复染30 s至1 min,水洗,自然干燥或吸水纸印干. 3.观察结果: 用油镜观察染好后的标本片,记录所见结果,染成紫兰色者为革兰氏阳性菌,染成红色者为革兰氏阴性菌. 注意事项 1.玻片一定要清洁无油. 2.加生理盐水切莫贪多以免难于干燥,涂片要均匀且薄. 3.固定标本时切勿过热,以免菌体变形. 4.要掌握好染色时间,尤其是酒精脱色的时间,不宜过长或过短,以脱色至涂片为灰色为宜. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.36 5.水洗时要以细流水徐缓冲洗,否则会将玻片上的标本冲掉. 二,细菌的基本形态与特殊结构观察 1.方法 (1)使用显微镜油镜,观察各种球菌,杆菌和螺形菌以及细菌特殊结构的示教片,比较各菌的形态,大小,排列和特殊结构特点. (2)绘图:将观察到的结果画在报告纸上并加以适当的描述. 2.结果 (1)细菌基本形态的观察 球菌:见排列方式不同的各种球菌,而且革兰染色性亦不同. 杆菌:大肠杆菌为革兰阴性的短杆菌;炭疽杆菌为革兰阳性杆菌,可见菌体粗大,两端平齐,酷似竹节状. 弧菌:弧菌为革兰阴性菌,菌体略带弯曲,呈逗点状或括弧形,霍乱弧菌涂片染色可出现鱼群状的排列特点. (2)细菌特殊结构观察: 肺炎链球菌(荚膜):肺炎链球菌为革兰阳性菌,成双排列.在双球菌体外围有一层较厚的透明区域,即为荚膜. 变形杆菌(鞭毛):变形杆菌为革兰阴性菌,通过鞭毛染色,可见菌体周围有细长弯曲的数根丝状物,即为鞭毛. 破伤风梭菌(芽孢):破伤风梭菌为革兰阳性菌.经芽胞染色后,可见菌体顶端有一圆形,比菌体宽的结构,即为芽胞.芽胞与菌体相连形似鼓槌状,在细菌中为独有的形态.肉毒梭菌菌体次极端有一椭圆形,比菌体宽的芽胞,与菌体相连,形似网球拍状. 三,细菌的动力观察(悬滴法) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.37 图3 细菌的动力观察(悬滴法)制片方法 1.取凹玻片两张,在凹窝周围涂抹少许凡士林. 2.各取一接种环的变形杆菌,葡萄球菌幼龄培养物,分别放于两块盖玻片中央. 3.将凹玻片反转.使凹窝对准盖玻片中心,覆于其上,粘住盖玻片后再反转.以接种环柄轻压盖玻片,使与凹窝边缘粘紧. 4.先以低倍镜找至悬滴的边缘后,再换用高倍镜观察(因凹玻片较厚,油镜焦距很短,故一般不能用油镜来检查). 5.观察时,注意比较变形杆菌和葡萄球菌的运动情况有何不同. 注意事项 1.观察悬滴标本时,先用低倍镜找到悬滴的边缘,然后将视野移至悬滴中央,将集光器下降,缩小光圈,使亮度减弱,再用高倍镜观察,否则亮度太强,不好观察. 2.调节螺旋时,切忌过度下旋,以免压碎盖玻片. 3.用接种环在试管中取材的方法(如图4): (1)左手拇指,食,中三指持试管底,右手拇,食,中三指握笔式持接种环,并垂直于火焰上烧灼至发红为止.移至火焰旁待冷. (2)在火焰附近用右小指夹取试管上的棉塞,移动后轻轻拔出,并持于小指与小鱼际之间,不得将棉塞放置桌上或触及任何物品. (3)将试管口移至火焰上旋转烧灼,灭菌后移至火焰附近,用冷却后的接种环插入试管内取少许生理盐水(若为液体则沾取一环菌液后退出),接种环不可与试管壁接触,以免环上生理盐水碰落.取出后立即将管口在火焰上转动灭菌后塞上棉塞.接种环使用后经烧灼灭菌插入试管架上. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.38 图4 接种环在试管中取材的方法 四,油镜的使用和保护 1.光源的采用 实验室里通常采用间接阳光,日光灯,或显微镜照灯.使用显微镜照灯时,通常要加一兰色滤光片,以滤过黄色光线. 观察染色标本时,要求有较强的光线,故应把光圈开足,把集光器上升至与载物台相平. 2.镜检要领 把载玻片固定于载物台上,利用低倍镜来对准光,并寻找标本范围,旋转回转板,使油镜头对准镜筒.于载玻片上滴一小滴香柏油,眼睛从镜筒侧面看,旋转粗调节器,使镜筒下降浸入镜油并贴近标本,但勿触及玻片.然后将眼睛移至目镜,一面观察,一面把粗调节器作些微转动,待看到模糊物象时,再旋转细调节器至物象清晰为止. 3.保护方法 (1)镜检完毕后,把镜筒升高,用擦镜纸把油镜头上的镜油擦净,如油已干,或透镜模糊不清,可以用擦镜纸沾少量二甲苯擦净,然后再用干的擦镜纸把二甲苯擦去. (2)旋转回转板,使物镜头呈八字形,降低镜筒,把集光器稍微下降,然后把显微镜装入镜箱,锁紧箱门,以防跌出及尘埃侵入. (3)显微镜应放置于干燥的地方,以防止镜头发霉,但也要避免阳光曝晒. (4)酸,碱,酒精,乙醚等物对镜头均有损坏作用,禁用于擦拭镜头. 注意事项 1.显微镜使用时应小心爱护,不得随意拆卸. 2.搬动显微镜时,用一手持镜臂,一手托镜座平端. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.39 3.载物台要放平,以防滴加的香柏油流出玻片. 4.玻片干后才能加香柏油,滴时要避免气泡形成,香柏油要适量,不宜过多或过少. 5.调节粗调节器时,动作要轻,侧面观察镜头和玻片的距离,注意使镜头与玻片不相碰. 6.用擦镜纸擦拭油镜头时,注意手法轻柔,并按同一方向拖拭,防止旋转擦拭,以免损伤贵重的油镜光学系统 五,电镜观察细菌的菌毛 1.将变形杆菌幼龄肉汤培养物制备成一定浓度的悬浮液. 2.滴于带有支持膜的铜网上,数分钟后吸去多余液体. 3.滴上染液,负染色12分钟. 4.吸去多余染液,干燥后即可电镜观察. 【思考题】 一,据实验体会,你认为制备染色标本时应注意哪些事项 为什么制片要完全干燥后,才能用油镜观察 油镜的使用和保护方法注意那些事项 二,细菌的形态检查法的基本程序是什么 细菌经革兰染色后,为什么有的呈紫色,有的呈红色 能否根据细菌在显微镜下的形态来鉴别细菌. 三,书写牙垢涂片革兰氏染色的实验报告并记录细菌的基本形态与特殊结构. 【附】 一,革兰氏染色法各种染液的配制 1.结晶紫染液 用天秤量取结晶紫5 g放乳钵内研碎,一面研磨一面徐徐加入95%酒精使之溶解.加入酒精全量为100 m1,制成酒精饱和液 (原液).取原液20 ml,与1%草酸铵水溶液80 ml混合,用滤纸过滤.供革兰氏染色初染用. 2.碘液 碘 1 g 碘化钾 2 g 蒸馏水 300 ml 配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾,然后加碘使其全溶解,最后加蒸馏水至300 ml.供革兰氏染色媒染用. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.40 3.稀释石碳酸复红染液 首先,取碱性复红10 g和95%酒精100 ml,制成复红酒精饱合液.取复红饱和液10 ml,与5%石碳酸水溶液90 ml混合,用滤纸过滤,再用蒸馏水稀释10倍.供革兰氏染色复染用. 二,鞭毛染色法(魏曦染色) 1.染液配制:2 ml饱和钾明矾液,5 ml 50 g/L石炭酸液和2 ml 200 g/L鞣酸液混合.临用时加1 ml碱性复红乙醇饱和液混合后过夜,次日过滤后使用,3 d内使用效果最好. 2.染色方法:先将鞭毛菌在肉汤培养基中传代67次.取琼脂斜面培养基吸出凝渗水,加入2 ml无菌蒸馏水,然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处,再从该交界处向上划一直线,放入温箱中培养16 h.用接种环从交界处取一环菌液,轻轻放入盛有34 ml蒸馏水的小碟液体表面,使细菌自由弥散,浮在液体表面,静置于孵箱内45 min后,用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上,切勿研磨和摇动.置35或室温下让其自然干燥,切勿火焰固定,加数滴染液染色0.5 1 min,水洗,干后镜检,可见菌体和鞭毛均呈红色. 三,荚膜染色法 1.染液:结晶紫乙醇饱和液5 ml加蒸馏水95 ml,混匀;20 %(200 g/L)硫酸铜水溶液. 2.染色方法:将经小白鼠传代培养的肺炎链球菌进行涂片,在空气中自然干燥,无需加热固定,先滴加结晶紫染液,在火焰上微微加热,使玻片上染液冒蒸汽为止.不要水洗,用硫酸铜水溶液冲洗,用吸水纸吸干后油镜观察,结果菌体及背景呈紫色,菌体周围有一圈淡紫色或无色的荚膜. 四,芽胞染色法 1.染液:石炭酸复红染液,95%乙醇,碱性美蓝染液. 2.方法:用芽胞菌制成涂片,干燥后加热固定,加数滴石炭酸复红液,微加热染色5 min,冷却后用流水冲洗,用95%乙醇脱色2 min,水洗,再加数滴碱性美蓝30 sec,水洗,吸水纸吸干后镜检.其结果为菌体呈蓝色,芽胞呈红色. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.41 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.42 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.43 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.44 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.（3）小试管（1012100mm）一般用于糖发酵试验或血清学试验，和其他需要节省材料的试验2德汉氏试管（Durham tube） 观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约636mm）（图I-2），此小套管即为德汉氏试管，又称发酵小套管。3吸管（又称移液管，pipette）（1）玻璃吸管（glass pipette）微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管（图I-3，A）。与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。市售细菌学用吸管，有的在吸管上端刻有“吹”字。除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管（图-3，B），来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。（2）活塞吸管（piston pipette）主要用来吸取微量液体，故又称微量吸液器或微量加样器。其外形和结构如图-4，除塑料外壳外，主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的吸嘴。按动按钮，通过弹簧使活塞上下活动，从而吸进和放出液体。其特点是容量固定，使用时不用观察刻度，操作方便、迅速。国内产品一般每个活塞吸管固定一种容量，分别有5、10、20、25、50、100、200、500、1000l等不同容量。而精制的活塞吸管每个在一定的范围内可调节几个容积，例如在525l的范围内，可调节5、10、15、20、25l五个不同的量，使用时按需要调节，但当调节固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用毕只需调换吸嘴或将吸嘴洗净，消毒后再行使用。活塞吸管是国外70年代后半期才开始生产与应用的，近年来国内亦日益广泛应用于免疫学和使用同位素等的科学实验中。4培养皿（petridish）常用的培养皿（图-5），皿底直径90mm，高15mm。培养皿一般均为玻璃皿盖，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养基表面干燥，例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。5三角烧瓶（Erlenmeyerflask）与烧杯（beaker）三角烧瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶发酵等。常用的烧杯有50、100、250、500、1000ml等，用来配制培养基与药品。6注射器（injector）一般有1、2、5、10、20、50ml等不同容量的注射器。注射抗原于动物体内可根据需要使用1、2和5ml的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。微量注射器有10、20、50、100l等不同的大小。一般在免疫学或纸层析等实验中滴加微量样品时应用。7载玻片（slide）与盖玻片（cover slip）普通载玻片大小为7525mm，用于微生物涂片、染色，作形态观察等。盖玻片为1818mm。凹玻片是在一块厚玻片的当中有一圆形凹窝（图-6），作悬滴观察活细菌以及微室培养用。8双层瓶（double bottle）由内外两个玻璃瓶组成（图-7），内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。9滴瓶（dropper bottle）用来装各种染料、生理盐水等（图-8）。10接种工具接种工具有接种环（inoculating loop）、接种针（inocula-ting needle）、接种钩（inoculating hook）、接种铲（inocula-ting shovel）、玻璃涂布器（glass spreader）等（图-9）。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍丝的直径以05mm为适当，环的内径约2mm，环面应平整。接种某些不易和培养基分离的放线菌和真菌，有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要求粗一些，约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻棒弯曲或将玻棒一端烧红后压扁而成。二、玻璃器皿的清洗方法清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。现分述如下：1新玻璃器皿的洗涤方法新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2的盐酸或洗涤液（见本小节“3”）。浸泡后用自来水冲洗干净。2使用过的玻璃器皿的洗涤方法(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架（图-10）上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2煤酚皂溶液（来苏尔）或025新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。(2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。量筒或标本瓶底部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2煤酚皂溶液或025新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸510分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡052小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在2煤酚皂溶液或025新洁尔灭溶液中浸泡24小时，然后按上法洗涤与保存。3洗涤液的配制与使用（1）洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：浓溶液 重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g自来水 150ml浓硫酸（工业用） 800ml稀溶液 重铬酸钠或重铬酸钾（工业用） 50g自来水 850ml浓硫酸（工业用） 100ml配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。配好后的洗涤液应是棕红色或桔红色。贮存于有盖容器内。（2）原理 重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸（chro-mic acid），酪酸的氧化能力极强，因而此液具有极强的去污作用。（3）使用注意事项 （a）洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌到时忘记将器皿取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即用水洗，再用苏打水或氨液洗。如果溅在桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去；（b）玻璃器皿投入前，应尽量干燥，避免洗涤液稀释；（c）此液的使用仅限于玻璃和瓷质器皿，不适用于金属和塑料器皿；（d）有大量有机质的器皿应先行擦洗，然后再用洗涤液，这是因为有机质过多，会加快洗涤液失效，此外，洗涤液虽为很强的去污剂，但也不是所有的污迹都可清除；（e）盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质；（f）洗涤液可反复使用，但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。三、空玻璃器皿的包装1培养皿的包装培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以58套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行于热灭菌。如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图-11），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。2吸管的包装准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约05cm处，塞一小段约15cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角（图I-12），并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。如果有装吸管的铜筒（图-13），亦可将分别包好的吸管一起装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用手持粗端拔出。3试管和三角烧瓶等的包装试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法见实验十九），然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。环境中的微生物因为微生物是肉眼看不见的，所以初学微生物学的学生常不知道外界环境和所有与外界接触的身体各部位均有微生物的存在。实际上它们广泛分布于室内外的空气、水和土壤中，桌、椅和板凳的表面，衣服以及身体的皮肤、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉头等的粘膜）等处，因此，可以说微生物是无缝不钻，无孔不入的。在学生第一次进入微生物学实验室时，建立起“微生物无所不在”这一概念是特别重要的，因为这样才能体会到无菌技术和环境卫生的必要性，才能防止外界微生物对培养物的污染，才能防止病原性细菌或病毒通过手或衣服进入人体而引起传染。从周围环境和体表各部取样生长出来的微生物，虽然大多数属正常菌群，但当进入破损的皮肤或传入口内或眼睛等处也会引起传染，这一方面是因为通过培养，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但当条件改变时也可能致病（称为条件致病菌），因此必须详细阅读操作步骤和听从指导者的说明，特别是用过的棉签和工作完毕后的培养物等均要放在指定的容器内，接种环不仅在用前必须烧灼灭菌，而且用后也应立即烧灼。这是整个微生物学实验课程和今后进行微生物学实验时均需注意的。下面的实验就是从实验室空气、实验台、门的旋扭（或把手）和人的头发、皮肤、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等处取样，接种于琼脂平板上，经培养12天后，观察并比较不同来源的微生物生长的数量和类型。实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查一、目的要求1证明实验室环境与体表存在微生物。2比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。3体会无菌操作的重要性。二、基本原理平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37温度下培养，12天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。三、器材肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。四、操作步骤每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。1写标签任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。2实验室细菌检查（1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。一小时后盖上两个皿盖。（2）实验台和门的旋钮（a）用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线，如图-1。（b）取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出（图-2，B），将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出（图-2，C）。放回棉塞（或试管帽）（图-2，D），并将空试管放在试管架上。（c）弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。（d）取样 将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2平方厘米的范围。（e）接种 按图-3，A在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下）（图-3，B），立即闭合皿盖。并按图-2，E和F，将原放棉签的空试管拔出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。（f）划线 另取接种环在火焰上灭菌，如图-4，先将环端烧热（图-4，1），然后将接种环提起垂直放在火焰上（图-4，2），以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次（图-4，3）。左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环（可在琼脂表面边缘空白处试温度，若发出溅泼声，表示太烫），通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直到平板的一半处（图-3，C）。注意：接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，使冷。接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，按图-3，D从上向下来回划线至12处。烧灼接种环，转动平板，按图-3，E，划最后14，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。3人体细菌的检查（1）手指（洗手前与洗手后）（a）分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（当然，班级、姓名、日期各项在每次写标签时是必不可少的）。（b）移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。（2）头发 在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。（3）咳嗽 将去盖琼脂平板放在离口约68cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。（4）鼻腔（a）按照实验台检查法的步骤（b）和（c），取出棉签，并将其弄湿。（b）用湿棉签在鼻腔内滚动数次。（c）按实验台检查法的步骤（e）和（f），接种与划线，然后盖上皿盖。4将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37培养箱，培养12天。5结果记录方法（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。菌落特征描写方法如下：（a）大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。（b）颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。（c）干湿情况 干燥、湿润、粘稠。（d）形态 圆形、不规则等。（e）高度扁平、隆起、凹下。（f）透明程度 透明、半透明、不透明。（g）边缘 整齐、不整齐。五、实验报告1结果（1）将你自己的平板结果记录于下表中。（2）与其他同学所做的结果进行比较。2思考题（1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？（2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？显微镜的构造、性能和使用方法由于微生物个体细小，因此我们必须用显微镜来研究它们的个体形态和细胞结构。熟悉显微镜和掌握显微镜的操作技术是研究微生物不可缺少的手段。现代显微镜一般可以分为两大类，一类是光学显微镜，另一类是非光学显微镜。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型，现列表如下：本部分包括普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和电子显微镜四个实验。目的在于使同学们通过这四个实验，对两种类型的显微镜有较全面的了解，并重点掌握明视野普通光学显微镜的使用。对于电子显微镜则着重了解其工作原理，并要求掌握制作电子显微镜标本的基本技术。实验二 普通光学显微镜一、目的要求1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2学习并掌握油镜的原理和使用方法。二、显微镜的基本构造显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图-1）。1机械装置镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。转换器（no sepiece）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装34个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2光学系统物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。