第章酶的作用机制和酶的调节.ppt

第10章酶的作用机制和酶的调节,一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例五、酶活性机制的调节控制酶在医学上的应用本章重点和知识点,一、酶的活性部位,酶分子上特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域，称为酶的活性部位（activesite）或活性中心(activecenter)。,（一）酶活性部位的特点,1、酶活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分（1-2%体积）；2、是一个三维实体；并不是和底物的形状正好互补，而有个动态的诱导契合过程；3、是位于酶分子表面的一个裂缝内（疏水区）；4、底物通过次级键（较弱的力：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用）结合到酶上；5、具有柔性或可运动性。,go,back,诱导契合假说：,为了解释酶能催化正反方向的反应，1964年Koshland提出“诱导契合”假说（induced-fithypothesis）。该假说认为当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合进行反应。,已糖激酶的诱导契合,back,（二）研究酶活性部位的方法,1、化学修饰（共价标记）：确定被修饰基团与酶活性的关系；2、酶动力学分析：比较底物和抑制剂对酶反应的影响；3、射线晶体衍射分析：比较纯酶与结合底物的酶的图谱，解析酶分子的三维结构；4、定点诱变（分子生物学方法）：研究酶的结构和功能的关系；5、切除肽段：确定肽段与酶活性的关系。,某些酶活性部位的氨基酸残基,酶分子侧链基团的化学修饰法：确定被修饰基团与酶活性的关系,可被化学修饰的基团：巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基和胍基等；（1）非特异性共价修饰；（2）特异性共价修饰。如：二异丙基氟磷酸（DFP）：专一性地与酶活性部位的Ser残基的羟基共价结合，使酶活力丧失；（3）亲和标记(affinitylabeling)法。如：TPCK与胰凝乳蛋白酶的底物TPE结构相似，TPCK与该酶保温后，酶活性部位残基被烷化，活性丧失。,back,二、酶催化反应的独特性质,1、酶反应分两类：一类仅涉及到电子转移，另一类涉及到电子和质子两者或者其他基团的转移；2、酶催化作用是由AA侧链上的功能基团和辅酶为媒介的，如H,S,C,K,E和D等的侧链；3、最适pH范围通常狭小；4、与底物相比，酶分子很大，但活性部位通常只比底物稍大一些；5、酶除催化反应所必需的活性基团外，还有别的特性（协同催化、底物结合部位、过渡态复合物等），使复杂反应能按一定途径进行。,back,三、影响酶催化效率的有关因素,酶能执行多种催化方式：酶提高反应速度的基本机制包括酶的活性部位结合底物后使底物产生邻近、轨道定向、应力等多种效应，它们增加反应物的有效碰撞，或者使受作用的化学键变形、削弱，或者使受作用的化学基团增加反应性，活性部位的催化基团可能提供共价催化（如亲核、亲电）、酸碱催化、络合催化等多种断裂键的方式。最终结果是稳定过渡态，使底物易于达到过渡态，降低反应活化能。,（一）底物和酶的邻近效应（approximation,proximity）与定向效应(orientation),邻近效应：ES复合物形成后，底物等的有效浓度升高使反应速率增加的效应；定向反应：反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。,（二）底物的形变（distortion）和诱导契合(inducedfit),张力学说：酶的活性中心与底物结合后，底物分子中不稳定的化学键受到牵拉或变形，从而易于断裂；,（三）酸碱催化（acid-basecatalysis）,广义的酸：提供质子；广义的碱：接受质子酸碱催化（多元催化）：酶蛋白中有好几种可以起广义酸碱催化作用的功能基，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。,（四）共价催化（covalentcatalysis）,底物与酶形成反应活性很高的共价中间物，易变成过渡态，大大降低反应活化能；,（五）金属离子催化：为反应定向、调节氧化还原反应、静电稳定或屏蔽负电荷等；（六）多元催化和协同效应；（七）活性部位微环境的影响：表面效应：活性中心多为“疏水口袋”，低介电环境中的基团之间的反应会得到加强。,back,四、酶催化反应机制的实例,（一）溶菌酶(lysozyme),椅式,半椅式,（二）胰核糖核酸酶（pancreaticribonucleaseA,RNaseA）,水解RNA的磷酸二酯酶;被测定顺序的第二个蛋白质,也即第一个酶;124AA,4对二硫键;专一性地切开嘧啶核苷酸3P-O键，生成3-嘧啶核苷酸或以其结尾的寡聚核苷酸。,化学修饰法研究：用碘乙酸处理，羧甲基化的His119是主要产物，羧甲基化的His12较少。两者均无活性，推测His1219和His12为酶活性的必需基团,RNase水解（Ala20-Ser21）得到S肽（20肽）和S蛋白（104肽），变性分离后无活性，但在中性下二肽段共同保温，则S肽和S蛋白依靠次级键结合，可恢复全部活性，叫做RNaseS,（三）羧肽酶（carboxypeptidaseA）,外肽酶,催化肽链C端的肽键水解；催化作用必需的3个基团：Zn2+、Arg127的胍基和Glu270的羧基；,羧肽酶的催化机制,1、活化的水的亲核O原子攻击底物羰基C原子；同时Glu270作为广义碱，从Zn2+结合水，吸取一个质子形成带负电荷四面体过渡态中间物，通过Zn2+和Arg127带正电的侧链的静电相互作用得以稳定；,2、Glu270的羧基作为广义酸提供质子给肽的NH基，肽键断裂，释放出aa,扩散离开，完成水解。,（四）丝氨酸蛋白酶（Serineproteases）,丝氨酸蛋白酶类是一个最有特色的酶家族。该家族包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、纤溶酶、组织纤溶蛋白酶原激活剂和乙酰胆碱酯酶（非蛋白水解酶）等；这个酶家族都有相似的酶催化机制，以酶的活性部件的丝氨酸-OH为亲核基团。反应中产生稳定的酰化酶和四面体中间物过渡态。,1、His57作为一个广义碱从Ser195吸取一个质子，促进Ser195亲核攻击要断裂肽键的羰基C；,2、His57作为广义酸供质子供给肽的酰胺氮，得到共价的质化胺，形成四面体中间物；,3、His57再作为广义碱接受水的质子；,4、His57再作为广义酸供质子给Ser的O；,5、中间体瓦解，产物胺解离释放。,Ser-His-Asp催化三联体,丝氨酸蛋白酶的催化机制：典型的酸碱催化和共价催化的例子。,CatalyticMechanismofSerineProteases,back,胰凝乳蛋白酶,Asp189,胰蛋白酶,Ser189,Ser189,有利于结合正电荷的Lys,Arg，裂解碱性AA,疏水AA环绕的口袋，大得足以容纳一个芳香残基，裂解芳香AA（Phe,Tyr）,Gly216,Gly226,Gly216,Gly226,Thr226,Val216,浅口袋，开口处有大的Thr和Val，故仅能容纳小的AA,弹性蛋白酶,五、酶活性的调节控制,通过对酶的催化活性的调节，就可以达到调节代谢活动的目的。可以通过改变其催化活性而使整个代谢反应的速度或方向发生改变的酶就称为限速酶或关键酶。有些酶活性是可以自身调节的，这种酶称为调节酶有两类调节酶，即别构调节酶和共价调节酶。,酶活性的调节方式：,一、酶结构调节（通过对现有酶分子结构的影响来改变酶的催化活性的调节方式，是一种快速调节方式）（一）别构调节（正、负协同效应，正、负反馈调节）；（二）共价修饰调节；（三）酶原激活；二、酶含量调节（通过改变细胞中酶蛋白合成或降解的速度来调节酶分子的绝对含量，影响其催化活性，从而调节代谢反应的速度）；（迟缓）三、同工酶调节。,back,一、酶结构调节（一）别构调节（变构调节）：,某些代谢物能与变构酶分子上的变构部位特异性结合，使酶的分子构象发生改变，从而改变酶的催化活性以及代谢反应的速度，这种调节作用就称为别构调节(allostericregulation)。具有别构调节作用的酶就称为别构酶。凡能使酶分子别构并使酶的催化活性发生改变的代谢物就称为别构效应剂。别构酶的别构部位（非底物结合部位）非共价结合别构调节物，并通过异促协同，改变酶与底物的结合，引起酶活性的抑制或激活。,1别构调节的机制：,别构酶一般是多亚基构成的聚合体，一些亚基为催化亚基，另一些亚基为调节亚基。当调节亚基或调节部位与别构剂结合后，就可导致酶的空间构象发生改变，从而导致酶的催化活性中心的构象发生改变而致酶活性的改变。,别构效应剂,催化亚基,底物,调节亚基,2协同效应：,当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂）结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别构酶的协同效应。如果对相邻亚基的影响是导致其对配体的亲和力增加，则称为正协同效应；反之，则称为负协同效应。,3.别构调节的方式：别构酶通常为代谢途径的起始关键酶，而变构剂则为代谢途径的终产物。因此，别构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键酶进行调节，最常见的为负反馈调节。4别构调节的特点：酶活性的改变通过酶分子构象的改变而实现；酶的变构仅涉及非共价键的变化；调节酶活性的因素为代谢物；为一非耗能过程；无放大效应。,别构酶的动力学,别构酶大都不遵循米氏动力学。有正协同效应的别构酶其v-S曲线具有S形，负协同则类似双曲线，说明酶对底物浓度的敏感性不同。某些寡聚酶解离成单体后，失去了别构调节能力，但仍保留活性，其v-S曲线为米氏曲线。,别构效应物,别构效应物，也称别构调节物。根据他们对别构酶的动力学过程的影响分为K系和V系。K系改变酶的K0.5，不改变Vmax；V系改变Vmax，不改变K0.5。,同别构效应,同别构效应的别构效应物为协同底物，即一底物分子结合促进其他底物分子与酶结合。因此，同别构效应是别构激活，其v-S曲线具有形。,异别构效应,异别构效应的别构调节物结构上不同于底物，异别构效应可能是别构抑制或别构激活。代谢途径中代谢终产物对早期酶的别构调节都是别构抑制。,例1：天冬氨酸转氨酶（ATCase,aspartatetranscarbamylase）,天冬氨酸转氨酶是研究得比较清楚的别构酶。催化氨甲酰磷酸与天冬氨酸反应生成氨甲酰天冬氨酸。该反应是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一步。图示该途径终产物CTP对ATCase的别构抑制。,CTP和ATP对ATCase调节的生物学意义：,1、ATP信号激活作用，提供DNA复制的能量，导致需求的嘧啶核苷酸的合成；2、CTP的反馈抑制则保证当嘧啶核苷酸充足时不需要该途径继续合成N-氨甲酰天冬氨酸及其后续中间物。,ATP与CTP相互竞争调节部位，高水平ATP可阻止CTP对ATCase的抑制作用,ATCase中亚基的排列：由催化亚基和调节亚基构成,2个C3（催化亚基）3个2（调节亚基）,ATCase催化肽链(c)与调节肽链()的关系,每个催化链含有1个氨甲酰结合结构域（N端）和1个Asp结合结构域（C端）,链domain1,有CTP结合部位,链domain2,与催化链互作,PALA（N-（膦乙酰基）-L-Asp）：酶的强抑制剂，与双底物的复合物及过渡态类似，与酶结合紧密；这种不发生反应的双底物类似物在ATCase的构象研究中很有价值。,ATCase的构象改变（1）PALA的结合导致每条催化链的三级结构发生重要变化，酶由T型变成R型,无配基的T态,有配基的R态,ATCase的构象改变（2）,用双底物类似物的结合实验和射线晶体结构研究揭示ATCase在别构转变中，调节亚基和催化亚基都经历了大的构象变化，结果催化亚基的催化链彼此靠近形成了最优化的活性部位。ATCase的别构效应是在相当大的立体空间范围内起着调节活性的作用。底物的协同结合和CTP的反馈抑制是通过长距离而传递的。通过肽链之间的各个表面的相互作用，信息从一个催化亚基的活性部位传递到其他催化亚基的活性部位。,解释别构酶协同转变的两个模型,back,2006年12月14日,第25,26学时（第13次课）,（二）共价修饰调节：,酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生共价修饰，从而导致酶活性的改变，称为共价修饰调节。共价修饰调节也是体内快速调节代谢活动的一种重要的方式。共价调节酶的多肽链接受其它酶的可逆或不可逆修饰作用，从而使酶获得或失去催化活性。能进行共价调节的酶至少存在两种不同的形式，即有活性或高活性形式和无活性或低活性形式。最常见的共价修饰方式有：磷酸化-脱磷酸化，-SH，-S-S-，乙酰化-脱乙酰化，腺苷化-脱腺苷化等。,1共价修饰的机制：,共价修饰酶通常在两种不同的酶的催化下发生修饰或去修饰;酶分子在有活性形式与无活性形式之间进行相互转变。,2共价修饰调节的方式：,共价修饰调节一般与激素的调节相联系，其调节方式为级联反应。,3共价修饰调节的特点：,酶以两种不同修饰和不同活性的形式存在；有共价键的变化；受其他调节因素（如激素）的影响；一般为耗能过程；存在放大效应。,蛋白质磷酸化和去磷酸化（1）,磷酸化和去磷酸化是一种广泛的共价调节方式。可供磷酸化的蛋白质侧链有：（1）Ser-OH、Thr-OH、Tyr-OH（P-O键连接）；（2）His的咪唑基（P-N键连接）。,蛋白质磷酸化和去磷酸化（2）,图中显示一个由于激素和细胞膜受体结合后引起的细胞内一系列蛋白质连续磷酸化过程。这些蛋白质由于磷酸化而激活。催化蛋白质磷酸化的蛋白激酶构成了级联系统。MAP即有丝分裂原激活蛋白，MAP被MAPK激活。有活性的MAP促进一系列基因转录表达，引起细胞分裂。,酪氨酸激酶(PTK,proteintyrosinekinase)作用原理,back,（三）酶原激活：,处于无活性状态的酶的前身物质就称为酶原。酶原激活指无催化活性的蛋白质被蛋白酶作用，断裂除去某个或某些序列后形成有催化活性的酶的过程。,酶原激活的机制为：酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子空间结构的改变，使催化活性中心得以形成，故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。酶原激活的生理意义在于：1、作为酶的贮存形式；2、保护自身组织细