EST文库构建原理和应用.ppt

EST文库构建原理和应用,目录：,EST概述EST序列原理EST产生原因EST的应用展望,EST概述：,表达序列标签（expressedsequencetags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列，指的是一组cDNA的部分序列,一般长度为150500bp,是由大规模随机挑取的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。一个EST代表生物某一时期的某种组织或细胞的一个表达基因。,注：cDNA,为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。,原理,ESTs（ExpressedSequencetags）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5末端或3末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约150500bp的一段cDNA序列。,EST产生的原因：,1990年人类基因组计划(HGP)及其它模式生物的基因组计划实施以来，人们对生物体生命现象的研究已不仅仅局限于局部某个或几个基因，而是把目光投向整个基因组，从整体水平去考虑基因的存在，结构与功能，以及基因之间的相互关系等.而如何快速、高效地从基因组中获取生物学信息，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前。EST技术就是基于这种认识而发展起来的，并成为基因组学研究的一个强有力的工具。,表达序列标签（expressedsequencetags,ESTs）,EST的制备程序,某特异组织总RNA的提取Poly（A）+mRNAcDNA两端加接头与zap载体连接、包装、裂解转染E.coli的XLIBlue细胞，进行invivoexcision用含有x-gal和IPTG的氨苄平板筛选随机挑取白色菌落提取质粒M13活T7通用引物测序。,EST技术流程,应用,EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。同样，对于一个DNA序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。,应用,构建基因组的遗传图谱与物理图谱(作为分子标记)；作为探针用于放射性杂交；用于定位克隆；(“电子”基因克隆)借以寻找新的基因；用于研究基因的功能；促进基因芯片的发展;用于研究生物群体多态性；有助于药物的开发、品种的改良；,构建基因组的遗传图谱与物理图谱(作为分子标记)；,ESTs在多种以基因为基础的人和植物基因组物理图谱构建中扮演着重要角色。在这一应用中，从ESTs发展起来的PCR或杂交分析可用来识别YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆类型的载体，它们是构建基因组物理图谱的基础，将EST与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有剩余基因序列的基因组区间，包括调控基因表达的DNA控制元件，对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的详细了解。物理图谱与遗传图谱间的相互参考，形成一个用途更广泛的综合资源，获得这张综合图谱后，研究人员就可以孟德尔遗传特征为基础，将相关基因定位在基因组区间上，并且通过查询以ESTs为基础的苈图谱，即可获得这一区间上所有基因的名单。该综合资源用途的大小取决于EST数据库中拥有的基因数目。目前人和小鼠EST的不断扩充使其应用更加广泛和便捷。,事例：,材料,日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库由南京医科大学陈淑贞教授构建。该文库系采用定向克隆构建于gt11/1090系统中，所构建的基因表达文库容量为3.13106重,方法：,结果：,重组克隆的分离及PCR鉴定,事例：,杨梅cDNA克隆测序图,作为探针用于放射性杂交；,用于定位克隆；,序列后得到相应克隆的EST,(3-1)ESTs与“电子”基因克隆；,利用计算机来协助克隆基因，称为“电子”基因克隆（sillconcloning），是与定位克隆、定位候选克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息学的方法延伸EST序列，以获得基因部分乃至全长的cDNA序列。EST数据库的迅速扩张，已经并将继续导致识别与克隆新基因策略发生革命性变化。,(4)借以寻找新的基因；,(5)用于研究基因的功能；,衰老叶片组织的EST序列分析,(6)促进基因芯片的发展,(7)用于研究生物群体多态性；(8)有助于药物的开发、品种的改良；,人类基因组计划已进入后基因组时代，基因组学的研究从结构基因组学过渡到功能基因组学，利用结构基因组学的同存数据，充分发挥