真核细胞常见表达载体

真核细胞的一般表达载体真核细胞，表达载体1，pCMVp-NEO-BAN托架特征：是真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，由CMVp启动子、兔-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨苄西林耐药基因及抗新基因、pBR322骨架组成，在大部分真核细胞中能在高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，在这个真核细胞表达载体内存在抗新基因，并转化为细胞感染后，用G418筛选，就能制造出具有稳定、高表达基因的细胞株。插入外源基因的复制站点是Sal1、BamH1和EcoR1站点。此托架有两个EcoR1站点。2，peg FP，增强的色带荧光蛋白表达载体(enhanced fluorecent protenin vector)特征： pEGFP表达载体包含绿色荧光蛋白，在由PCMV启动子驱动的真核细胞中高水平表达。载体骨架的SV40origin在表达SV40 T抗原的所有真核细胞内复制该载体。neo电阻箱由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin耐药基因、HSV-TK基因的多胺信号组成，并能稳定筛选出转染的真核细胞株G418。此外，载体的pUC origin可以确保大肠杆菌中该载体的克隆，位于此表达框上游的细菌启动子可以诱导大肠杆菌中卡那霉素耐药基因的表达。用途：在表达载体EGFP的上游有Nde1、Eco47111和Age1复制部位，在该部位加入外源基因纽结，合成外源基因和EGFP的融合基因。通过这种方法，可以确定细胞内外源基因的表达和/或组织内的位置。还可以用于检测克隆的启动子活动(CMV启动子替代，Acet1-Nhe1)。3、peg ft-actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特征： peg FP-actin表达载体包含绿色荧光蛋白和人牙髓-肌动蛋白基因，由PCMV启动子驱动，在真核细胞中高水平表达。载体骨架的SV40origin在表达SV40 T抗原的所有真核细胞内复制该载体。neo电阻箱由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin耐药基因、HSV-TK基因的多胺信号组成，并能稳定筛选出转染的真核细胞株G418。此外，载体的pUC origin可以确保大肠杆菌中该载体的克隆，位于此表达框上游的细菌启动子可以诱导大肠杆菌中卡那霉素耐药基因的表达。用途： pEGFP-Actin载体在真核细胞中表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白整合到细胞内产生的肌动蛋白(肌动蛋白)中，在活细胞和固定细胞中观察细胞中包含肌动蛋白的子细胞结构。4，pSV2表达载体特征：该表达质粒由真核细胞目的基因由病责SV40启动子表达，复制部位为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞选择特异性。该载体不包含新基因，不能用于筛选和制造稳定的表达细胞系。5，CMV4表达载体特征：真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区酶部位选择度更高。包含氨苄西林耐药基因和生长基因片段，SV40克隆原点和fl单链克隆原点。但是值得注意的是，该表达载体不包含新基因，因此不能用细胞转染后的G418筛选稳定的表达细胞系。其他常见克隆Vector:PBluscript II KS DNA 15 ugPUC18 DNA 25 ugPUC19 DNA 25 ug说明：PBluescript II kS、pUC18 Puc19载体适用于DNA片段的克隆、DNA测序和外源基因表达等。因为这些载体在lacZ基因中包含多个复制部位，所以将外来的DNA片段放在扦上转换lacZ基因的细胞缺乏，在包含IPTG和X-gal的培养基中培养时，包含外来DNA载体的细胞变成了白色菌落，不包含外来DNA片段的细胞则是蓝色菌落，因此很容易筛选没有外来DNA片段的载体。这些载体中还有M13、T7、T3的通用引物，它们便于DNA排序。保管额： TE BufferTE Buffer配置：10mM Tris。HCL(Ph 8.0)1mM EDTA用途：克隆外源DNA片段。进行基因表达。使用M13、T7和T3引物排序。存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调节过程。一些生命活动的机制还不完全。由于插入人的目的基因不同，载体制造板栗的顺序成分不同，组装空间的位置不同，使用的表达系统不同，因此目的基因表达水平和阳性克隆审查率有很大差异。此外，由于所有连续成分的种类和组织特异性，所产生的高效表达载体不一定能在所有细胞株中有效地表达出来。另外，细胞生长状态的差异，转基因方法的不同培养中去势的长度，药物浓度的高低，也对表达量有很大的影响。所以要综合评价一个表达载体和表达体系，排除一些不确定性，选择最佳组合真核表达载体倾向于有利于扩增目的基因和良性克隆筛选的载体的构建。发现了许多广泛使用的强大的启动子和增强子，并应用于载体，目标基因的表达得到了显着提高，一些强大的成分启动子，如SV40早期启动子PHTLv，应用于批量生产细胞株。以GS为筛选标记的表达载体的应用可以同时具有筛选和扩增目的基因的两个功能，是当前研究的重点。用IRES连接的双纯半形表示向量已经成为核表示向量的本体。在同一启动子操作中，筛选或报告基因和目标基因在同一mRNA中通过IRES转录的作用表达了两种蛋白质，因此理论上，筛选或表达报告基因的克隆成为阳性克隆，即表达对象基因