生物信息学序列分析利用生物信息学进行功能基因的电子隆技术.ppt

一、基因克隆的策略,在对目的基因进行克隆时所采取的策略十分重要，其途径大致分为：正向遗传学途径反向遗传学途径电子克隆(insiliconcloning)一种全新的方法。,正向遗传学是指通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。功能性克隆(functionalcloning)、表型克隆(phonetypicalcloning)等，如：遗传病基因的克隆。反向遗传学的原理正好相反，首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找有关的表型变化。如：基因剔除技术、转座子标签技术等。图位克隆？,简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化结构基因组学的研究为反向遗传学研究提供了大量的待鉴定的基因序列，因此反向遗传学研究也成为功能基因组学研究的一个重要手段。,1.功能性克隆(functionalcloning)1.1纯化后克隆若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因，除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。,当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5端的引物合成，根据mRNA3端poly-A序列指导合成poly-T的3端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物物中合成相应的cDNA，将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。,1.2同源性克隆生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，基于此原理，在其它种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因，当然在没有全同源探针的情况下，可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。,2.表型克隆(phonetypicalcloning),细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生)，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，以下方法用来发现分化表达差异性基因。,2.1递减杂交(substractivehybridization)由Lamar和Palmer在1984年提出，作为较早运用研究差异性表达基因的手段，其主要思路如下：从实验组和对照组细胞中抽提mRNA，逆转录成cDNA后，用限制性内切酶切割成片段，并将对照组cDNA片段用S1核酸酶切平，然后以数种限制性内切酶将其切成很小的片段，在一定条件下，用大大过量的实验组cDNA与对照组cDNA相混合，经变性再复性，使来自对照组小的cDNA片段与实验组中的长链cDNA杂交，以选择性除去二者间的杂交体。,这样，在实验组表达而在对照组中不表达的目标基因被富集并可被分离，将这些保存有粘性末端的目标基因同质粒或噬菌体相连接，从而构建出减数文库，并可使用探针从文库中筛选出实验组特异表达的基因，常应用于癌基因和抗癌基因筛选，其主要缺点是：操作耗时长，工作量大，难度较大且可能存在着基因缺丢失的现象。,2.2差异显示PCR(mRNAdifferentialdisplayDD，DDRT-PCR)1992年由PengLiang和A.B.Pardee等率先使用，在核酸分子水平上显示了mRNA表达水平的差异。其主要原理是：以某组织或细胞的全部RNA或mRNA为模板，利用以3端PolyA设计的锚定引物以及5端任意引物进行逆转录反应和多聚酶链式反应(RT-PCR)，PCR扩增产物可在Sequence胶上显示该组织或细胞中的mRNA组成。被证实有差别表达的mRNA被回收，并重新扩增，扩增产物经克隆、测序后作为一个标记可被收入基因库并与基因库中的其他序列比较。,该方法简便、灵敏，它能够快速地显示细胞mRNA的组成，可对各样本mRNA的差异同时进行比较和展示，并可立即进行cDNA测序、亚克隆、探针标记及文库筛选等工作；其缺点是假阳性条带多、对低丰度表达基因不易检测、基因克隆受mRNA表达时效影响、其扩增出来的条带常在基因3端的UTR区，所提供的信息比较少。,2.3差异显示分析或代表性差异分析(RepresentialDisplayAnalysisRDA)由Lisitsyn等1993年发明，快速有效，可特异放大分化差异基因片段，具体思路如下：从实验组和对照组抽提RNA或mRNA，逆转录生成双链cDNA，将两种cDNA都用识别4碱基的内切酶Dpn充分酶切，加入R-24、R-12分子，退火连接之后除去多余的R-12分子后将cDNA分子补平，以R-24分子为引物，对照组与实验组cDNA进行PCR扩增，得到两个cDNA代表群。,将这两个代表群分别用Dpn酶充分酶切后，在酶切之后在实验组中加入J-24/J-12接头分子，然后以1100的分子比与参照组混合杂交，除去多余的J-12分子，并用聚合酶将cDNA分子补平，加入J-24引物进行PCR扩增，由于只有对照组的分子才能与J-24引物退火配对，因而在杂交后形成3种杂交体分子：实验组/实验组，实验组/对照组，对照组/对照组中，实验组/实验组只能以指数形式扩增，实验组/对照组以线性扩增。通过电泳分析或将占优势的差异分子克隆至载体而获得新分子基因。与DDRT-PCR相比，具有假阳性少，重复性好，其代表性完全且较大的片段也可以被扩增的优点；此外cDNARDA不仅可对不同阶段基因的不同表达进行监测，还可以用于非poly(A)结尾的mRNA的检测。其缺点是酶消化的结果可能使cDNA两端的信息量丢失。,2.4扣除杂交或抑制消减杂交法（SSHSuppressionSubtractiveHybridization）其依据的技术主要有两点：消减杂交和抑制性PCR，利用链内退火优于链间退火，比链间退火更稳定，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似于“平底锅”的结构，无法与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增；同时根据复性动力学原理，即浓度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于浓度低的单链cDNA，从而使原来在浓度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。,其特点是：速度快、效率高，可同时分离几十或上百个差异表达的基因；假阳性率低，其阳性率高达94%；敏感程度较DD和RDA高，一些低丰度表达的cDNA可被检出；并可以大量特异扩增那些代表了有差别表达的cDNA片段，减少了实验结果的复杂性。,2.5基因表达系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE)技术细胞或组织的RNA逆转录为cDNA，分别使用锚酶及标签酶酶切，分离出每个cDNA上的标签(tag)，经连接成双标签(ditag)，分析其组成，去除变形体后，经PCR扩增、酶切后，串联ditag，对照基因文库，查出不同tag代表的不同基因及可能的基因产物，如果在文库中无匹配的序列，就有可能发现了新的基因；同时还可利用SAGEtag的丰度确定基因表达丰度。但是由于SAGE技术所得到的标签信息量少，对未搜索到的匹配序列的标签鉴定存在困难，因此该技术主要局限于GenBank、EST数据丰富的生物，如人类、小鼠、大鼠等。,2.6cDNA微阵列或芯片(DNAmicroarrayorchip)技术近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术，其实验包括6个步骤：将cDNA克隆加工为可供点印的材料；将cDNA克隆(或寡核苷酸)点印到载体上；样品RNA的分离(总RNA或mRNA)；探针的制备(例如cDNA的合成和标记)；标记的探针DNA与载体上的DNA杂交；杂交结果的成像和图象分析。主要应用于：基因表达水平的检测；通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可能致病基因或疾病相关基因；可进行基因点突变、多态性检测及染色体结构研究。其最为主要的优点是：可自动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况；并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。,3.图位克隆(map-basedcloning)上世纪90年代初期图位克隆应运而生，成功完成了诸如人NPCI等基因的克隆，其大致原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN文库(如YAC、BAC或Cosmid文库)，构建出目的基因区域的物理图谱，再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosomelanding)的方法，,最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。定位克隆理论上适用于一切基因，但也存在应用上的一些不足：构建叠跨克隆群可能存在着困难；精细作图成本很高；定位克隆不能提供基因功能的相关信息，需借助其他手段。,4.转座子标签(transposontagging)技术转座子是染色体上一段可以移动的DNA序列，它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位，当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时，就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型，通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA片段，获得含有部分突变株DNA序列的克隆，,然后以该DNA序列为探针，筛选野生型植株的基因组文库，最终得到完整的目的基因。该技术主要用于植物基因的克隆，由于可供利用的转座子的种类太少，而转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体，限制了转座子标签法的应用范围。,二、电子克隆基因（Insilicocloning）,（一）、电子克隆的特点：挖掘和克隆功能基因是利用基因工程技术进行植物品种改良、有效利用基因资源的基础。基因克隆的传统方法主要是图位克隆和转座子标签法克隆等，但这些方法操作技术复杂，成本高，实验周期长，在基因克隆中并没有能得到非常广泛的运用。最近发展起来的mRNA差异显示技术、抑制差减杂交技术和基因表达系列分析技术由于其操作相对简便、效率高，已成为功能基因克隆的重要手段，在许多实验室得到应用，但其主要缺点是得到的cDNA都不是全长cDNA，必须通过cDNA文库筛选或RACE的方法才能获得全长cDNA，进一步用于基因的功能分析和转基因研究。,电子克隆(insilicocloning)是近年来伴随着基因组计划和EST(expressingsequencetag)计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR的方法快速获得功能基因，具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。,（二）EST简介1什么是表达序列标签（Expressionsequencetag，EST）？短cDNA序列，完整基因的某些片段。单次文库测序产生的cDNA，一般在400-600bp，GenBank中大约70是EST。,2EST如何产生？从特定的状态的组织或细胞中分离RNA，将RNA逆转录成cDNA亚克隆到载体中，利用载体上的引物对插入片段测序测序出来的片段结果即称为ESTs(expressedsequencetags)。,3使用EST时应该注意的问题：（1）由于是单次测序结果，序列的精确度较低，存在较多错误。(大约2%error，HGP错误率标准是0.01%)，表现在：缺失、替代、插入等错误（与mRNA相比）。测序中的错误引发大约1.5%的利用oligoT产生的EST无法与已知的mRNA的3端比对上。倒置（5端和3端弄反，插入克隆载体时出错）。嵌合EST（5端和3端来自不同mRNA）。,（2）重复结果多，不同EST往往来自同一个基因因此，对dbEST进行blast时最好用blastxandtblastx。,随着人类基因组计划的实施，已有研究人员利用电子克隆的方法克隆了很多人的功能基因。由于受到序列资料的限制，植物基因的电子克隆还鲜有报道。目前在GenBank中已经登录了大量的EST数据，而且EST每天还在高速地增长。例如，在2002年初，我国华大基因公司和瑞士Syngenta公司同时公布了水稻基因组的序列框架图，因此可以利用生物信息学技术全面开展分析和鉴定水稻等植物的功能基因。,（三）国际上3大核酸数据库（含有大量的EST数据）,国际上三大核酸数据库,EMBL：欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory,其下有EuropeanBioinformaticsCentre)，主要位于英国剑桥Cambridge和德国汉堡Hamburg。GenBank：由美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)建立。该中心隶属于美国国家医学图书馆，位于美国家卫生研究院(NIH)内。DDBJ：日本DNA数据库(DNADataBankofJapan）,由theNationalInstituteofGenetics,NIG主管。,这3个大型数据库于1988年达成协议，组成合作联合体。它们每天交换信息，并对数据库DNA序列记录的统一标准达成一致。每个机构负责收集来自不同地理分布的数据（EMBL负责欧洲，GenBank负责美洲，DDBJ负责亚洲等），然后来自各地的所有信息汇总在一起，3个数据库的数据共享并向世界开放，故这3个数据库又被称为公共序列数据库（PublicSequenceDatabase）。所以从理论上说，这3个数据库所拥有的DNA序列数据是完全相同的。你可以从中选择一个你喜欢的数据库；但是如果你的研究需要实时(24小时以内)的，则要注意这些数据库间的记录是会有差异的。,北京大学生物信息学中心(CentreofBioinformatics,PekingUniversity):北京华大基因研究中心：,我国主要的相关研究机构,（四）利用EST数据库信息进行电子克隆利用EST数据库信息进行功能基因的电子克隆是目前最常用的手段。首先选择感兴趣的EST作为查询探针，搜索dbEST数据库，找到部分重叠的EST进行拼接，然后再以拼接好的EST重叠群(ESTcontig)为新的查询探针，继续搜索dbEST库，直到没有新的EST可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。,目前利用EST序列拼接获得水稻等植物的完整cDNA的研究已经有一些报道。例如，南京农业大学的黄骥等以来源于水稻盐胁迫cDNA文库的1个500bp的ESTS121为信息探针搜索位于GenBank的水稻EST库，发现有2个EST与S121部分序列一致，经过拼接组装获得了1个886bp的全长cDNA序列，同源性比较的结果表明其可能编码一个新的水稻锌指蛋白基因，根据拼接好的序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法成功分离了该基因的完整cDNA克隆，命名为OsZFP，该锌指蛋白可能涉及到水稻幼苗的盐胁迫应答反应。,此外，对某种植物来说，除了利用其自身的EST作查询探针外，还可以选择其他物种尤其是亲缘关系较近的物种全长或EST作为查询探针，搜索dbEST库，进而拼接成完整的cDNA序列。其主要理论依据是不同物种同类基因之间存在序列保守性。,唐向荣等发现2个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域(dsRBD)有同源区域，根据同源片段设计引物，用RT-PCR的方法从水稻愈伤组织中扩增得到了1.8kb的cDNA片段，该cDNA含有完整的编码区，有两个典型的dsRBD，与大白菜BcpLH基因的dsRBD在氨基酸水平上相似性为75%左右。黄骥等以玉米全长6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶cDNA为查询探针，搜索水稻dbEST数据库，发现了几十条高度同源的水稻EST，通过序列组装和拼接获得了1.8kb左右的cDNA序列，进一步用RT-PCR的方法克隆了水稻的6-磷酸葡萄糖酶基因。,（六）利用基因组信息进行电子克隆的策略在GenBank中已经登录了庞大的小鼠、大鼠和人类等多种生物的EST数据资料，所以利用EST拼接它们的全长cDNA序列相对容易些。同时，基因组信息也在迅速增加，如在2002年初，中国华大公司将水稻基因组序列的测序结果无偿地在Internet上公布，供全世界免费使用，这无疑促进了水稻等植物功能基因的电子克隆。,利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发育时期或特殊环境条件的限制，可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的EST或全长cDNA序列作为信息探针搜索位于GenBank或者我国华大公布的水稻基因组序列，随后根据内含子“GU.AG”的规则通过人工拼接或相应的计算机软件预测，可以得到该基因完整的开放读码框(ORFopenreadingframe)，根据拼接的序列结果设计PCR引物，进一步采取RT-PCR的方法获得目的基因的cDNA克隆并进行序列测定。,事实上，电子克隆往往是结合以上两个方面即EST数据库和基因组信息资料同时进行的。因为EST数据直接代表的是表达序列，所以在电子克隆的拼接中占有非常重要的地位。一般策略是对于任何一个感兴趣的序列首先进行EST拼接，无法继续拼接后再进行基因组比较和外显子预测，以判断EST拼接的完整性。当然序列拼接只是在计算机上的“虚拟克隆”，还需要通过RT-PCR、序列测定和Northern杂交等方法进行验证和基因表达水平的鉴定。,随着生物信息学的迅猛发展，Internet上已经开发了一些EST拼接和基因结构分析的软件，其中大多数都是免费提供，大大加快了电子克隆的速度。EST拼接软件的原理是，计算机程序自动将用户提供的EST序列与EST数据库比较，构建EST重叠群，得到尽可能长的EST拼接的序列反馈给用户。基因结构分析包括外显子预测、启动子预测等。,外显子预测主要指从DNA中找到编码蛋白质的部分即外显子部分。因为不同的物种在外显子剪接、启动子序列上存在一些难以确定的差异，所以不同的程序其外显子的预测效果也不尽相同。在利用基因组拼接的过程中，为了分析基因的启动子区域可以使用启动子预测软件，以确定启动子的位置以及更准确地确定基因结构预测的结果。,另外还有一些预测转录起始位点、Poly(A)加尾信号、转录因子结合位点的软件，都可以验证基因组拼接的结果，并对自己感兴趣的序列作出结构和功能的预测。当然，利用网上程序预测的基因结构不可能是100%可靠的，应该同时利用几个程序预测的结果并结合自己的拼接经验综合考虑，确定最有可能的基因结构。,（七）电子克隆中电子延伸是其中最为重要的一步，电子延伸系统应该有以下几个部分组成：预处理(preprocessing)、聚类(clustering)、拼接(assembly)和分析(analysis)。,预处理1.除去载体序列2.将ESTs序列将与人重复序列库(RepBase，/)比较，除去重复序列，这样可以提高拼接的效率。3.其它潜在的污染序列(如线粒体、核糖体DNA序列等)4.还有几种污染属于研究前沿，至今没有很好的解决。包括：如果是EST序列，要去除来自基因组DNA的污染、来自pre-mRNA的污染、跨越非常规内含子（不是以GT或GC开头和AG结尾的内含子）的EST，这些都会影响拼接的成功率和正确率。,聚类在对大量ESTs数据进行分析时，情况比较复杂，从概念上区分“聚类”和“拼接”是必要的。聚类过程的目的是将标记同一基因相同转录本的、具有重叠部分(overlapping)的ESTs整合至单一的簇(cluster)中。,拼接使用生物信息学软件进行，如：PHRAP(phragmentassemblyprogram)/index.htmlCAP3该软件是CAP（contigassemblyprogramme）的改进版本，可在线进行。CAP3在线服务：/aat/sas.html,TIGRassemblerzESTassemblerMIRA2:/mira_downloads.htmlGigAssembler:/learithe/browse/goldenPath/algo.html,分析及文库构建如果要验证拼接是否正确，或同时想经过比对对结果再进行延伸，就需要与转录组数据库和蛋白质组数据库进行比对。,（八）电子克隆中的一些常见问题和对策,电子克隆虽然在执行速度上有很大的优势，但在实际应用中常常会碰到一些非常棘手的问题，针对这些问题，列出了以下解决方案。(1)有时难以获得完整的5端序列。这是电子克隆中遇到的最主要问题。因为植物基因的5端保守性一般比较低，在以基因组序列为基础的电子克隆中尤其难以确定。根据Kozak规则以及我们的经验，对于完整ORF的5的完整性一般有以下几条原则：,1)参考5端的起始密码子AUG的周围序列(GCC)GCCA/GCCAUGG规则；2)在起始密码子上游的同阅读框序列中是否存在终止密码子；3)根据已有的其他物种该类基因的5端序列与预测物种5端的序列一致性比较。另外也可以根据Northern杂交的结果判断该基因转录本的大小。,(2)对于通过基因组结构预测获得的基因，有时候难以确定其表达的时期，给RT-PCR验证带来困难。一般可以根据其功能预测或查找相关的文献资料确定该基因的表达时期，也可以同时测定各个时期和不同组织的表达谱加以判断。(3)有些查询探针是来自与水稻同源关系较远的物种，给基因结构的人工分析带来困难。这种情况下可以借助于基因结构预测软件，使得结构分析变得简单而且准确。由于水稻基因的基因组序列平均只有4.5kb，只要将该基因估计的基因组序列(10kb)进行预测，一般都能得到比较准确的结果。,（九）电子克隆技术的展望,电子克隆技术是随着基因组和EST计划的发展而产生的，开始主要应用于人类。2002年年初我国水稻基因组序列资料的发布使得水稻基因的电子克隆成为可能。相信电子克隆很快就会在水稻的基因克隆中占有非常重要甚至主导性地位。与传统的基因克隆方法相比，电子克隆主要有以下优点：1)速度快。包括同源性比较、序列拼接组装等工作在计算机上完成，只需RT-PCR序列验证即可。2)投入低。电子克隆只需能够上网的计算机和PCR仪等仪器即可进行，实验成本较低。3)技术要求低。实验室工作只涉及到RNA抽提、反转录、PCR扩增等分子生物学的基本实验，研究人员很容易掌握。4)针对性强。,拟克隆基因的生物学功能大都比较明确，一旦获得即可直接应用于转基因技术进行作物品种改良。随着遗传图谱与以序列为基础的物理图谱的整合，直接将目的基因与连锁标记的遗传距离转换为物理图距后的电子克隆有可能成为取代传统的图位克隆的重要措施；而对于采用抑制差减杂交、差异显示或基因表达系列分析等方法得到的EST采取电子克隆的方法获得全长cDNA的策略，则可成为取代RACE或cDNA文库筛选的最佳方案。,电子克隆技术的产生很可能从此改变植物基因研究的策略，人们关注的焦点更多地集中于克隆基因的功能研究，在很多规模较小的实验室可以轻易地建立起基因克隆-转基因功能研究的实验体系，使得水稻基因工程的内部联系更加紧密。除此之外，人们还可以利用电子克隆技术，以水稻为研究对象在基因水平上研究某些复杂事件或途径的机制。综上所述，电子克隆在今后的基因克隆中将起到不可替代的作用。伴随着基因组计划出现的电子克隆必将大大加速基因结构、功能研究的进程，推动比较基因组学的发展和水稻基因的进化、起源方面的研究，使得我们赖以生存的水稻更好地造福于人类。,电子克隆小结和举例说明,利用公共数据库信息,借助计算机软件分析,推测目的基因的编码区序列,辅助全长cDNA克隆的方法,ESTwalking基于染色体DNA序列的电子克隆,5,3,EST,SearchinESTdatabase,SearchinESTdatabase,SearchinESTdataba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