药敏试验的再认识

抗生素广泛使用，甚至滥用，造成耐药的细菌越来越多，药敏试验的作用显得愈加重要。由于各种细菌耐药的机理和程度互不相同，不同的药敏试验方法，检测结果会存在一定差异。对于药敏试验的理解和使用中应注意的问题，概括如下几点。 一、药敏试验的目的和性质药敏试验的目的是检出细菌的耐药性，确定病原细菌对哪种药物有抗药性，避免医生将其作为治疗用药。“耐药”是药敏试验的正结果。只有已知可能出现耐药菌株的药物才需要做药敏试验。如青霉素是金黄色葡萄球菌感染的首选药，但耐药株很多，必须做药敏试验。已知没有耐药性的细菌不做药敏试验。如化脓链球菌对青霉素无耐药株，常规不做药敏试验，实际上，目前还没有相应的药敏试验方法。已知细菌全部耐药的药物更不必做药敏试验。如耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)不应做氨基苄青霉素的药敏试验。正确认识药敏试验的目的，利于有针对性地选择药敏试验的药物；根据细菌的耐药特点，开发新的药敏试验方法。药敏试验是定性试验，理论上说，只有“耐药”和“敏感”两种结果。细菌耐药，表示不能按常规或以往成功的经验进行治疗，敏感的含义相反。抗菌治疗，要求药敏试验提供选择或不选择某种药物的依据，回答必须是肯定或否定，所以是临床治疗的需要决定了药敏试验的性质。在常规实验室，将药敏试验提高到定量水平一般没有临床价值。比如，肠球菌对万古霉素，最低抑菌浓度(MIC)4 g/ml为中度耐药或耐药1。用筛选试验或纸片法便可检出耐药株，确定能否使用该药。用定量方法，无论测出MIC是8 g/ml或64 g/ml，临床没有更大的价值。二、细菌对药物的敏感特征对特定药物，一种细菌的MIC值是从小到大连续不断，还是跳跃的?回答是后者。绝大多数情况，一种细菌对一种药物，表现为敏感：MIC值较低，和耐药：MIC值较高，两个群体，少有中间状态。如粪肠球菌，万古霉素敏感菌株，MIC2 g/ml，耐药菌株MIC16 g/ml。也有只表现为敏感或耐药或中度耐药一个群体的，如母鸡肠球菌万古霉素MIC48 g/ml。如果将这两种细菌混在一起，MIC是连续的，这是假象。也有表面看MIC连续的情况，多见于生长较慢或以诱导酶方式耐药的菌种。如有的耐药粪肠球菌，24小时培养MIC值较低，继续培养至48小时，MIC值变高。所以，表面连续，实际不连续。个别的现象是肺炎链球菌对青霉素，MIC范围0.158 g/ml，从敏感、低水平耐药到耐药，连续2。这一现象有待研究。敏感菌株，MIC值分布一般在45个稀释度之间。稀释法药感试验的允许误差范围是3个稀释度。如果考虑进这个误差，菌株间MIC值差别不大，这符合生物种的基本规律。三、适合常规使用的药敏试验方法纸片法最适合常规实验室使用。其特点是方便、易操作，测定的药物随意可变，灵活性强。重要的是纸片法药敏试验有一套完善的质量控制方法，结果相当可靠。纸片法唯一的不足是中度耐药的菌株会出现问题，如低水平耐药的肠球菌，因其抑菌环处在中介范围，使结果不易确定。所以，在纸片法试验结果不宜判断时须用筛选试验或测MIC。目前，在美国由于大量使用仪器，微量稀释法很普遍。一般讲，微量法较常量法难控制，特别是接种菌量的掌握，要求很严，固而用微量稀释法检测MRS、肠球菌等结果会不可靠。1993年NCCLS药敏试验分委会主席Jorgensen博士撰文列出稀释法试剂盒的诸多缺点，如药物不能自由选择，缺乏完善的质量控制菌株，试验如果污染无法发现等问题。他认为多数实验室使用自动化仪器并未发挥出应有的经济效益3。筛选试验是最好的常规药敏试验方法。它是在解决常规实验室检测MRS、耐药肠球菌的问题中诞生的。筛选试验由稀释法简化而来，设计目的非常明确，即检出耐药性。预计将来会成为常规实验室的主要方法。常规实验室一般在做研究工作时才使用稀释法测MIC。细菌对各种药物的MIC是已知的。早在药物的开发阶段，药效试验(测MIC)必做，然后才可能应用于临床检验。即便对新出现的耐药性，早期的研究人员也将MIC测出。如万古霉素敏感的肠球菌MIC2 g/ml，低水平耐药菌株MIC48 g/ml，耐药菌株MIC16 g/ml。常规实验室测临床分离株的MIC没有更多价值。测MIC在有的情况下必不可少。如金黄色葡萄球菌对万古霉素MIC2 g/ml。1996年，在日本首次发现了中度耐药的菌株，测MIC8 g/ml，后经美国疾病控制中心证实4。1997年，美国也报道了类似的菌株。至今尚未发现MIC更高的菌株。四、关于中度耐药、中介中度耐药，惯称中度敏感。“耐药”是药敏试验的正结果，中度耐药更确切。以往，当药敏试验结果不能明确判断为敏感或耐药时，对可提高剂量的定义为中度耐药，对不能提高剂量的定义为中介。中介的概念出现在纸片法药敏试验中，认为属于试验误差。然而，就目前的某些细菌的情况看，中度耐药的菌株确实存在。例子之一是万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌，MIC8 g/ml。肺炎链球菌对青霉素，MIC0.158 g/ml，内含中度耐药。另一种现象是某些肠杆菌对氯霉素中度耐药(纸片法)。在WHO的质评中出现过氯霉素药敏试验结果报告敏感、中介和耐药都正确的事例。原因是氯霉素对沙门菌最有效，其他细菌并不一定有效，MIC往往位于中介范围。这是细菌的特点，不是试验误差。一般细菌通常不应做氯霉素药敏试验。对于临床医生，中度耐药是含混的概念，应尽量避免使用。发报告“中度耐药”应以“耐药”的形式报告，避免医生误选。五、药敏试验的评价方法及指标诸多药敏试验方法中，肉汤稀释法是标准方法，琼脂稀释法也可认为属于标准方法(稀释法药敏试验对质量控制要求较高，特别是微量稀释法，必须做质量控制，否则会出现较大误差。具体方法须依照NCCLS文件的有关部分。)。其他任何方法必须与标准方法比较，才能确定可靠性。其他方法之间相互比较没有太大价值。比较须平行测定耐药菌株和敏感菌株。耐药菌株，被评价方法与标准方法的误差称极重要误差，不得大于3%；敏感菌株，被评价方法的误差称重要误差，不大于7%3。不同的药敏试验方法，针对不同药物，可靠性不一样。如测MRSA须高盐条件，有的试剂盒中不加盐，结果不准确，但这不影响肠球菌的测定结果。所以，评价一种方法，应该是有针对性地验证一种细菌对一种药物测定结果的可靠性。六、质量控制及其校准作用纸片法药敏试验用敏感菌株做质量控制。此外，ATCC25923，ATCC25922，ATCC27853三个菌株还具备校准作用，此点往往被忽视。在NCCLS有关文件中，质量控制一节的第一部分就是讲方法的校准。据笔者经验，由于培养基和操作的原因，国内大部分实验室的药敏试验没有经过校准，试验的准确度差异很大。校准过程中，须注意用适合的参考菌株校准相应菌类的药敏试验。如葡萄球菌药敏试验用ATCC25923校准；肠杆菌药敏试验用ATC