第五章 电泳技术.ppt

第5章电泳技术，第1节电泳基本概述。肝素通过糖凝胶电泳鉴定：肝素是一种酸性粘多糖，由D-氨基葡萄糖硫酸盐和葡萄糖醛酸分子组成。其水溶液带有很强的负电荷，在琼脂凝胶板上电场的作用下向正方向移动。其移动位置应与肝素国家标准一致。药物的等电点是样品脱盐后用等电点聚焦法测定的(多区、多等电点)，同一批同一产品的等电点应相同，说明该过程是稳定的。掌握电泳技术的基本原理。掌握PAGE不连续系统的原理和技术。掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和技术。了解电泳前沿技术如等电聚焦电泳、双向凝胶电泳和毛细管电泳的原理和应用。了解电泳相关技术的原理和应用。教学目的，发展概况，物理学家在1809年首次发现电泳现象。迈克尔斯在1909年首次将电场电泳中的胶体离子运动称为。1937年，蒂塞琉斯发明了蒂塞琉斯电泳仪，并建立了研究蛋白质运动界面的电泳方法。还首次证明血清由白蛋白和、球蛋白组成。1948年，维兰德和费歇尔重新开发了以滤纸为支持介质的电泳方法来分离氨基酸。自20世纪50年代以来，区域电泳使用了各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)。)作为支持媒体。1959年，雷蒙德和魏特劳布利用合成凝胶作为支持介质，开创了现代电泳的新时代。20世纪80年代发展起来的毛细管电泳新技术。70年来，电泳技术围绕凝胶制作、电泳和染色三个技术环节不断完善，实现了以下目标：1 .提高分辨率和灵敏度。2.简化操作，缩短电泳时间。3、扩大适用范围。电泳技术的基本原理电泳：带电粒子在电场中的定向运动。分离物质的两性特征：电泳：指的是一种方法，其中带电粒子，如蛋白质、核苷酸、其他粒子分子或离子，在电场的作用下以各自的速度向其相应的电极移动，以分离成分，然后检测或计算百分比含量。溶液中粒子迁移的驱动力：粒子的有效电荷和势梯度。它们与介质的摩擦力竞争。在自由溶液中，这种竞争遵循斯托克斯定律V:=6rv，F摩擦力R粒子半径，V移动速度，介质粘度，V:swimming速度厘米/秒或最小D :swimming距离CMT :电泳时间(秒/分)V:电场强度伏特/厘米。U:游动速率或游动度(cm/v/sec或min) U:电压常压(100-500 v)高压(500-10000 v)只需几分钟l:支持场长度(有效长度)，迁移率：单位电场强度下带电粒子的游动速度。影响电泳速度的因素，粒子特性，直径，形状，静电荷。电场强度：电场强度越高，带电粒子的迁移速度越快。大气压：2-10V/cm溶液性质：酸碱度，离子强度(最合适的：0.02-0.2)，电极溶液和蛋白质样品溶液的溶液粘度。电渗：实现液体与固体载体的相对运动。当粒子的运动方向与电渗方向一致时，粒子的迁移率加快。反之亦然，达拉斯至礼堂焦耳热：目：(1)根据支持物的物理性质分类：滤纸和其他纤维素的凝胶电泳：醋酸纤维素、玻璃纤维等。琼脂、聚丙烯酰胺凝胶等的粉末电泳。淀粉、纤维素粉、玻璃粉丝电泳：微电泳；2)电泳的分类，(2)根据电泳的基本原理分类：1，自由界面电泳：在溶液中的一个U形管中，其构型和电荷相同区域电泳：在电泳过程中，应用各种惰性支持介质，使不同游动速度的组分在电场作用下形成各自区域的电泳。常用的支持物包括滤纸、醋酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。在第二部分中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区域电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前最常用的电泳方法。首先，聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是以不同孔径的聚丙烯酰胺凝胶为支撑，采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层、缓冲溶液的离子组成、酸碱度和电位梯度不连续)，使样品在不连续的两层凝胶之间聚集和浓缩，形成非常窄的样品带(厚度为0.1毫米)，然后分离，提高了分辨率。聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点是，设备简单，样品量小(1-100微克)，时间短(30-60分钟)，操作方便，分离范围广(多肽、蛋白质、多糖等)。)可提高超微量测定的灵敏度(10-12-10-9)可用于蛋白质分子量，2、聚丙烯酰胺凝胶性能和制备，1。性能稳定，机械强度好，纯度高。制备原理：2.1制备原料：丙烯酰胺(Acr)、亚甲基双丙烯酰胺(Bis)。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在促进剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(NH4)2S2O3 (AP)或维生素B2(维生素B2)的作用下聚合交联成三维网络结构，以凝胶为载体的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。光聚合：核黄素作为催化剂(太阳光、太阳光)制备大孔凝胶。化学聚合：制造小孔胶。过硫酸铵(NH4)2S2O3APS(引发剂)N，N，N，N-四甲基乙二胺TEMED(促进剂)，2.2聚合模式。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的。四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)促进了这一聚合过程。活化的单体和未活化的单体开始聚链的延伸，延伸的聚链也可以随机连接二丙酰胺，使聚链交联形成网状三维结构，最后聚链聚合成凝胶。NH，CH2，丙烯酰胺N，N-亚甲基(亚甲基)双丙烯酰胺聚丙烯酰胺，反应方程式：3。凝胶浓度与交联度和孔径的关系，凝胶浓度(T):丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的总百分比浓度。交联度(C):有效孔径取决于总凝胶浓度T%，有效孔径随T%的增加而减小。有效孔径决定蛋白质分离。应特别注意丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统的损害。丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺应避光储存。混合溶液不应储存超过一个月。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应，样品浓度效应凝胶的分子筛效应电荷效应。样品浓度效应：由凝胶系统的不连续性产生。(1)凝胶孔径的不连续性，(2)缓冲溶液离子组成的不连续性，(3)酸碱度的不连续性，(1)凝胶孔径的不连续性单体浓度交联度大孔胶：T=3%C=2.0%大孔胶：T=7%C=2.5%，凝胶网目尺寸：聚合物链长3:交联度：从Acr浓度Bis浓度低，孔径大，单体和Bis的浓度可在聚合前调节，如：在分离胶的界面处，由于分离胶的小孔径和大阻力，速度减慢。由于其不连续性，样品集中在大孔和微孔凝胶之间的界面上，区域变窄。凝胶浓度(t)的选择与分离物质的分子量密切相关。适用于大孔凝胶中分子量范围/(%)蛋白质51052-5核酸pr-Gly-(pr压制成薄层)的凝胶浓度：Gly的有效迁移率要求低于所有pr，且计算的ph值为6.7。在小孔凝胶中，Gly被要求超过所有的Pr，Pr被留下用于普通的电泳和分子筛分离，以被分成多个区域。(测得的酸碱度为9.5)，上下罐缓冲液(Tris-Gly，酸碱度8.3)、浓缩凝胶缓冲液(tris-HCl，酸碱度6.8)和分离凝胶缓冲液(tris-HCl，酸碱度8.8)的浓度(即孔径)也不同。在这种条件下，盐酸在缓冲体系中几乎完全解离成氯离子，甘氨酸(=6.0，pKa=9.7)在两个槽中只有一小部分解离成甘氨酸负离子，而酸性蛋白也能解离负离子。这些离子在电泳过程中都向正方向移动。C1速度最快(领先离子)，其次是蛋白质，甘氨酸阴离子最慢(落后离子)。由于C1-迅速超过蛋白质离子，在它后面形成一个电导率较低、电位梯度较陡的区域，该区域的电位梯度最高。这是电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和甘氨酸离子的加速移动。结果，在蛋白质进入分离凝胶之前，快离子和慢离子被浓缩成薄层，这有利于提高电泳的分辨率。(4)分子筛效应蛋白离子进入分离凝胶后，条件发生很大变化。甘氨酸解离成负离子的效果由于酸碱度的增加而增加(电泳通常超过9.0)。同时，由于凝胶浓度的增加，蛋白质的游动受到影响，流动性急剧下降。这两个变化使甘氨酸比蛋白质移动更多。上述高电压梯度不再存在，蛋白质根据其分子大小在相对均匀的酸碱度和电压梯度环境中移动。分离凝胶的孔径有一定的大小。对于具有不同相对分子量的蛋白质，它们通过的阻断程度是不同的。由于这种分子筛的作用，即使净电荷相等的颗粒也会分离出不同大小的蛋白质。三种物理效率使得样品分离效果好，分辨率高。(1)一般电泳分离的电荷效应多，分子量小，迁移快；(2)不连续体系对样品迁移率的浓度效应被压制成薄层；(3)凝胶对样品分子的筛选作用；(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。7S安全性：敏感性：简单性：特异性：速度：稳定性：协同作用：静脉注射。考马斯亮蓝R250:灵敏度比氨基黑10B高5倍，但不适用于酸溶蛋白和醇溶蛋白。考马斯亮蓝G250:灵敏度不如R250，但不溶于酸性溶液，局部无色。测试灵敏度为30100ng，线性范围为20倍。银染色法：机理：蛋白质带上的硝酸银(银离子)还原成金属银，银颗粒沉积在蛋白质带上。银染蛋白质的吸光度与其浓度呈线性关系。蛋白质染色的程度与蛋白质上的特殊基团有关。碱性和含硫氨基酸的存在有助于染色。银染应首先修复。固定有两个功能：第一是将蛋白质固定在凝胶中以防止扩散。其次，为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原剂和缓冲溶液中的成分(甘氨酸)。固定剂包括戊二醛、乙醇、甲醇乙酸和三氯乙酸。染色分为二胺银染色和非二胺银染色。银染色的线性范围为40倍，灵敏度为试验染色的100倍。二胺银染色工艺：1。将胶水浸泡在50%的甲醇中至少1小时。2.将溶液A 0.8g硝酸银配制到4毫升去离子水中。B21毫升0.36%氢氧化钠和1.4毫升14.8摩尔氢氧化胺。3 .将甲滴入乙中，加入去离子水至100毫升。该溶液在使用前立即制备并染色15分钟。4 .用去离子水冲洗5分钟。5 .显色溶液：2.5毫升1%柠檬酸与0.25毫升37%甲醛混合，向500毫升中加入去离子水。经过约10分钟的颜色发展，蛋白质带出现。6.用去离子水冲洗并用50%甲醇停止显色。ANS方法：1-苯胺基-8-萘检测限为100微克。如果不明显，将胶水从暴露的空气中取出或浸泡在3摩尔盐酸溶液中2分钟，使蛋白质表面稍微变性，然后染色。检测线增加到20微克。酶和抗体染色后能保持活力。它可以用来测量酶的活性或给动物注射抗原。氨基黑10B法：它是一种酸性染料，其磺酸基团与蛋白质反应形成复合盐。氨基黑染料对SDS蛋白的染色效果不佳。当对不同的蛋白质染色时，色度不同，色调不同(蓝色、黑色、棕色)，纯度扫描的误差太大。阴性染色：显示胶表面被染色，而蛋白质斑点是透明的。速度快(5 15分钟)，并能保持蛋白质的生物活性。该技术主要包括使用金属盐染料、锌咪唑染料等。胶体扩散染料：用于检测以高灵敏度电转移到硝酸纤维素和聚偏氟乙烯膜的蛋白质，不用于凝胶染色。这项技术主要包括印度油墨染料、胶体金属染料等。有机荧光团染料：包括共价键合和非共价键合的荧光团染料。其典型代表是商品化的红色、橙色、红宝石等荧光染料。金属螯合染料：可以方便地与集成的蛋白质组学平台(包括自动凝胶比色计、图像分析工作站、机器人剪切仪、蛋白质酶解工作站和质谱仪等)相结合。)。第3节SDS-PAGE，概述：成立于1967年，1969年完善。在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS后，蛋白质分子的迁移率取决于其分子量，因此可用于测定分子量。几种电泳方法的比较：管状凝胶电泳、垂直平板凝胶电泳和水平薄层凝胶电泳。SDS电泳原理，SDS性质：表面活性剂，带负电荷。蛋白质的形状：球状和线形。SDS与蛋白质结合后的状态：椭圆形棒。蛋白质的分子量只与长度有关。SDS是一种阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质的氢键和疏水键，与蛋白质分子以一定比例结合形成复合物，使蛋白质的负电荷量远远超过其原始电荷，掩盖了各种蛋白质分子之间的天然电荷差异。因此，电泳中各种蛋白质-SDS复合物的迁移率不再受原始电荷和分子形状的影响，而只是杆长的函数。这种聚丙烯酰胺凝胶电泳方法被称为SDSPAGE。影响蛋白质与SDS结合程度的因素，溶液中SDS单体的浓度，样品缓冲液中二硫键的离子强度是否完全降低，SDS聚丙烯酰胺凝胶的组成和聚合，凝胶分为均匀凝胶和梯度凝胶。梯度凝胶可提高蛋白质分子量10%-15%的分离范围，适用于10-250，000 MW: 1的共混。丙烯酰胺质量2。最大限度地减少应付账款、提存金额。3.控制聚合时间(40-60分钟)温度30-50度4室温12小时，制备样品，组成样品缓冲液：甘油、溴酚蓝、还原剂(DTT)、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氯化铵样品处理：热变性特殊样品处理：样品加载浓度：考马斯亮蓝染色：20-30 ng/微升银染色：0.3-0.5 n