第二章基因工程的酶学基础2006.ppt

第一段限制性内切酶、第二段脱氧核糖核酸连接酶、第三段脱氧核糖核酸聚合酶、第四段脱氧核糖核酸修饰酶、第二段基因工程酶学基础、第一段限制性内切酶和第一段限制性内切酶是能够识别双链脱氧核糖核酸分子中特定核苷酸序列(4-8bp)并从中切割脱氧核糖核酸双链的内切酶。(限制性内切核酸酶)，两个相邻核苷酸残基之间的磷酸二酯键，2。特性，核酸内切酶。原核生物，一些霉菌和蓝细菌。也就是说，在核酸分子链内部形成切口的酶。自我保护。3.细菌的功能、限制和改造系统(R/M系统)，1。来源：限制性内切酶将入侵细菌的外源DNA切割成小片段。(1)限制性：细菌的DNA碱基受甲基化酶的甲基化修饰保护，不能被其自身的限制性酶识别和切割。(2)修饰，(1) DAM甲基化酶，在GATC腺嘌呤N6位引入的甲基，和(2) Dcm甲基化酶，CCAGG或CCGG序列，在第二个C上的C5位引入的甲基，在甲基化酶的作用下，从供体分子S-腺苷甲硫氨酸到限制性酶识别序列的特定碱基，即I型限制性酶，已经鉴定出三种不同类型的限制性酶。第二类限制性内切酶第三类限制性内切酶第一类限制性内切酶第二类限制性内切酶和甲基化是分开的，第二类限制性内切酶的序列特异性是于1968年由米塞尔森和袁从大肠杆菌菌株b和菌株k中首次分离的。(1)识别位点序列，ECoB:TGA(n)8 tgTecoK:AAC(n)6 gtgc，类型1。I限制酶，如ecob和ecok。非甲基化修饰的特定序列。n:代表任何需要三磷酸腺苷、镁和腺苷甲硫氨酸(S-腺苷甲硫氨酸)作用机制的核苷酸，(3)在距特定识别位点约1000-1500 BP的距离处随机切割单链。(2)1970年，史密斯和威尔科克斯首次从流感嗜血杆菌中分离出裂解位点。(1)识别位点序列，非甲基化修饰双链DNA上的特殊靶序列(主要是回文序列)。不管DNA的来源，2。第二类限制性内切酶。分离的第一种酶是Hind。回文结构是指与回文相似的一段DNA序列，它有两个特点：1 .以一对核苷酸为中心轴，左右两侧相同数量的核苷酸互补。2.如果两条脱氧核糖核酸的阅读方向相同(例如5/3/)，它们的核苷酸序列相同：5GTATCCGGATAC 33CATAGCTATG 5，(2)在切割位点切割双链脱氧核糖核酸。形成粘性的或钝的。例如：在识别站点。(3)粘性末端(内聚性末端)，包含几个核苷酸的单链末端。分为两种类型：(1)5端突出(例如EcoRI切点)，gaattc，CTT aag，gaattc，CTT aag，5-，-3，-3，-5，-5，-5，-3，-5，-5，从5-p端切割双链DNA以产生5-p单链延伸粘性端，CTGCAG，(2)3端突出(例如PstI切点)，GAC GTC，5(1)容易连接，(4)粘性末端的含义，I)不同的DNA双链体：只要粘性末端的碱基互补，它们就可以连接。ii)相同DNA的分子内连接：可以通过两个相同的粘性末端连接成环状分子。这比连接两个平齐端容易得多。突出的3末端可以通过末端转移酶添加几个多核苷酸(如AAA或TTT)的尾部来人工粘着。5端标记，突出的5端可以用32P的DNA多核苷酸激酶标记。粘性末端可以用脱氧核糖核酸聚合酶整平，形成一个平的末端。同位旋酶：具有不同来源和相同识别位点序列的限制性酶。(5)型限制性内切酶的一些特殊性质，相同的切割酶：识别位点和切点完全相同。比如hindiii和HsuI。hind5 -AAG CT-3 3 -TTC GAA-5 hsu i5 -AAG CT-3 3 -TTC GAA-5 具有相同的识别位点，但具有不同的分界点。比如XmaI和SmaI。不完全异构酶：已鉴定的序列不同，但可以切掉相同的粘性末端。如BamHI、bgl ii、BclI、xho ii等。5-ggatcc-3 3-cctagg-5 ，bamhi，bcli，5-tgatca-3 3-actagat-5 ，5-agatct-3 3-tctaga-5 ，bgl ii，5-ugatcy-3 3-yctagu-5 ，xho ii，u代表嘌呤；y代表嘧啶。2。等臂体，5-GATC-3 3-CTAG-5 ，SAU 3A，由等臂体粘性末端结合形成的新位点，不再能被原始酶识别。什么？5-G3-CCTAG，GaTCT-3 A-5 ，巴米，BGL二号，5-GGATCT-3 3-CC TAGA-5 ，巴米，BGL二号，SAU 3A，3。第三类限制性内切酶在完全阳性位点切割DNA，但反应需要三磷酸腺苷、镁和腺苷蛋氨酸。它在基因工程操作中用处不大。Ecop 1: agacc，ecop 15: cag，限制性内切酶的类型和主要特征，综述，限制性内切酶的定义二限制性内切酶回文的特征在结构上不同于尾酶同构酶，完全回文有两个基本特征： _ _ _ _ _， _ _ _ _ _。(可以在中间画一条对称轴，两边的序列对称互补配对；两条互补链的53的序列组成是相同的，即如果一条链旋转180，两条链重叠)。你认为下列哪一个序列最有可能是第二类酶的识别序列：GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA？为什么？答：空中交通管制；因为它们是回文序列。1973年奥斯麦和丁纳坦斯提出的命名系统的命名原则如下：3 .限制性内切酶的命名，使用由属名的第一个字母和种名的前两个字母组成的三字母首字母缩略词来代表宿主细菌的种名。大肠杆菌由Eco表达。流感嗜血杆菌由欣指示。限制性内切酶应该以R开头，修饰酶应该以M开头(现在省略)。菌株或类型由带右下标的大写字母表示。例如Ecok、EcoR(现在并行写入，例如EcoRI)。如果在特定的宿主细菌中有几种不同的限制和修复系统，它们用罗马字母表示。如EcoRI、EcoRV。切割频率指的是预测的核酸分子中限制性内切酶的数量。由于DNA由四种类型的单核苷酸组成，假设DNA的碱基组成是均匀的，限制性内切酶的识别位点是随机分布的，任何限制性内切酶的切割频率理论上应该是1/4n，n代表限制性内切酶识别的碱基数。如果识别出一个具有4个碱基的限制性内切酶，其切割频率应为每256个碱基一个识别序列和切割点(44=256)，而一个具有5个碱基的限制性内切酶每1024(45)个碱基应该有一个识别序列和切割点。限制性内切酶的切割频率和DNA中的杂质如蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸等。会影响酶的活性。(1)DNA的纯度，(5)影响限制性内切酶活性的因素，(1)DNA的纯化，(2)酶剂量的增加(每微克DNA底物5-10个酶单位)，(3-4小时)培养时间的延长，(4)反应体积的扩大，使得潜在的抑制因子相应地被稀释(20l).一般来说，大肠杆菌一般有两个甲基化酶修饰的质粒，(2)甲基化程度的脱氧核糖核酸和甲基化酶(在GATC修饰的甲)；Dcm甲基化酶(c修饰的铬化砷酸铜/TGG)。甲基化酶失活突变株必须用于基因工程。不同限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37摄氏度，少数需要40-65摄氏度。温度是影响酶活性限制的一个重要因素。4。缓冲液、缓冲液的化学成分、氯化镁、氯化钠/KCl:提供Mg2和离子强度；三盐酸：保持ph值；二硫苏糖醇(DTT):保持酶的稳定性；牛血清白蛋白等：有助于稳定酶；市售的限制性酶通常带有特殊的缓冲液。限制性内切酶的识别和活性在一定条件下(如温度、离子强度、酸碱度等)通常表现出最好的切割能力和位点特异性。限制酶的活性，如果改变反应条件会影响酶的特异性和切割效率，称为星号(*)活性。因此，通常使用特定的反应缓冲液。，星号(*)活动，EcoRI和BamHI都有*活动。它可以在低盐和高酸碱度(8)下被识别和切割。美国航天技术协会、美国航天技术协会、美国航天技术协会等。GAATTC、EcoRI，使用时要特别注意！综上所述，诱导星形活性的因素如下：(1)甘油含量高(5%，v/v)；(2)限制性内切酶过量(100U/微克DNA)；(3)低离子强度(25毫摩尔/升)；(4)高酸碱度(高于8.0)；(5)含有有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)、乙醇等。(6)存在Mg2以外的二价阳离子(例如Mn2、Cu2、CO2、Zn2等。)。5.酶对消化效率的影响，但在实际应用中，一般需要用少量过量的酶(1g加25U酶)长时间反应才能实现完全酶解。但是酶的量不能增加太多吗？过量的酶对切割反应的影响：1)、过量的酶(一般为100u/ gdna)会影响识别序列的正确性，如：BamHI正常识别序列：GGATTC酶过量识别序列和酶制剂含有甘油成分。过量的酶会影响识别特异性，并由于大量的甘油而导致星号活性。(6)限制性酶对DNA的消化，(1)限制性酶与识别序列的结合模式，(1986) J.A .麦克林等人发现，通过x射线晶体衍射，第二类限制性酶以同二聚体的形式与靶序列结合。核酸内切酶的所有识别位点都被切掉了。完全消化只切除了有限数量的切割位点。局部消化可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的量来实现。局部消化大多数酶可以通过65孵育5分钟而失活。或者用乙醇沉淀DNA。4.限制性酶消化反应的终止，5。几种常用的限制性内切酶识别位点，6。限制性酶识别序列的交叉列表，1。严格地说，限制性内切酶是指一种被证明是_ _ _ _ _的酶。在基因工程中，识别_ _ _ _ _的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。练习，限制-修改系统的一个组成部分；双链DNA分子中的特定核苷酸序列，以及从中切割的DNA双链结构)。2.序列5-CGAACATGAGGAGT-3包含6bp第二类限制性内切酶的识别序列。这个网站的顺序是什么？答：回文序列是5-cattg-3。为什么大量的核酸内切酶被称为“限制性”酶？大多数内切核酸酶是限制性内切核酸酶，仅在特定位点起作用。此外，限制性内切酶主要用于切割外来片段(如感染的噬菌体DNA)。噬菌体对宿主是特异性的，因为在其他生物中，它的DNA将成为细胞限制系统的目标。从这个意义上说，核酸内切酶限制了宿主的范围。根据细菌DNA环化现象，一定有一种酶可以将两条DNA双链连接在一起。第二节脱氧核糖核酸连接酶1。发现脱氧核糖核酸连接酶1967年，几个实验室发现了同时在两条脱氧核糖核酸链之间形成磷酸二酯键的酶，(1)大肠杆菌连接酶(大肠杆菌钠)，1。大肠杆菌基因组中lig基因编码的两种DNA连接酶，只能连接粘性末端。(2)脱氧核糖核酸酶的特性，(2)T4噬菌体的连接酶，它是由脱氧核糖核酸30编码并从被T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离的产物。不仅可以连接粘性末端，还可以连接平齐末端。(1)必须是两条双链DNA。(2)脱氧核糖核酸在3端有一个游离羟基，在5端有一个磷酸基团。(3)在动物或噬菌体中，能量是必需的：三磷酸腺苷大肠杆菌：脱氧核糖核酸，2。连通性条件，1。三磷酸腺苷提供激活的腺苷。3。连接反应的机理，2。三磷酸腺苷和连接酶形成共价“连接酶-腺苷酸(腺苷酸连接到连接酶的赖氨酸-氨基)”复合物，焦磷酸质子泵抑制剂被释放。3。连接酶-腺苷酸复合物与3-羟基和5-P基团的间隙结合，腺苷酸与磷酸基团反应，并使其与3-羟基接触，生成新的磷酸二酯键，从而封闭间隙。Oc-c-CH2-CH2-CH2-NH2、h3n、amp、三磷酸腺苷、质子泵抑制剂和3.1amp然后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到一条DNA链的5末端p，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-oh，ho-p-，amp，-oh，o-p-，amp，3.2.3-oh对磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键并释放AMP。连接酶反应的最佳温度是37。最适温度，但粘性末端的结合在37时非常不稳定。2.实际温度，一般采用4 16C。增加了插入片段与载体之间的接触机会，减少了载体的自连接现象。1。插入片段与载体的浓度比，2。反应温度，12.5。5.影响连接反应的因素，1020次。一般来说，连接酶的浓度为1416，3。在平端DNA的连接反应中，反应酶的最适用量为12U，只有0.1U的粘端才能达到最佳的连接效果。4.当连接温度为1216时，连接反应时间为116小时。如果温度较低，反应时间会延长。限制性内切酶产生的内聚性末端连接属于分子内连接，而齐平末端