超敏乙肝详解

项目编号 上海市医疗技术临床应用能力技术审核申请书技术名称： 高灵敏度HBV DNA病毒载量检测（PCR法） 申请单位： 上海市普陀区中心医院 主管部门： 上海市普陀区卫生局 申请时间： 2015 年 1 月 9 日 上海市医学会二0 年 月申请须知一、本申请表的内容均为真实信息；二、严格按照医疗技术临床应用管理办法的有关规定，建立和完善技术应用的规章制度和操作规范，确保医疗安全；三、注意病例资料的整理和分析，及时总结临床应用信息，按期接受评估；四、如应用期间发生医疗技术临床应用管理办法第四十一条所规定情形的，立即暂停临床应用并上报市卫生局；五、如应用期间发生医疗技术临床应用管理办法第四十四条所规定情形的，报请市卫生局决定是否需要重新进行医疗技术临床应用能力技术审核。 六、申请的医疗技术距上次同一医疗技术未通过临床应用能力技术审核时间未满12个月的不得申请。 项目负责人阅知并签章 日期 填表说明 一、本市辖区内凡申请医疗技术临床应用的医疗机构，均应填报本表。二、申请书各项内容，必须实事求是，内容真实，表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。三、所有填写入表格的技术人员必须是取得执业资格，经卫生行政部门注册在本单位的在编或正式聘用人员。四、本申请书一式八份，用A4纸打印。五、电子版申请书一份（刻录成光盘）。六、本申请书应附如下资料：1. 医疗机构执业许可证副本及其复印件（加盖单位公章）2. 医疗机构医学伦理审查报告（附：伦理委员会成员姓名、专业、职务、职称等情况）3. 该技术的相关管理制度和风险防范预案4. 与本项目相关的医疗器械或药品注册证书、经营厂商营业执照及经营许可证复印件（加盖公司及医疗机构公章）5. 国内外有关该项技术研究和使用情况的检索报告及技术资料6. 卫生行政部门要求的其他相关文件。 七、项目编号由上海市医学会填写。一、医疗机构基本情况名称上海市普陀区中心医院性质综合性医院 专科医院 其它：医院等级三 级 乙 等 其它：总占地面积27163平方米床位数1000 张在编人员1352人单位地址上海市兰溪路164号邮政编码医疗机构主管部门普陀区卫生局医疗机构联系人联系电话（手机）项目联系人康向东联系电话（手机）电子邮箱传真021-相应诊疗科目登记情况HBV DNA 定量检测相应科室设置情况检验科分为：生化室、免疫室、细菌室、分子生物学室、临检室（门诊、急诊）二、申请单位相关学科基本情况（一）项目负责人姓 名康向东性 别男出生年月1959.2所在科室检验科执业医师资格证书编号毕业学校上海交通大学医学院学 历博士学 位博士专 业检验专 长肿瘤免疫工作年限29相应技术工作年限12职 称主任技师获得职称时间20041.何时何地开始从事本项目的专业工作2003年上海市普陀区中心医院检验科2.本项目专业培训（进修）情况时间地点指导医师操作例数参与例数其他需说明情况个人专业工作简述含主要科技成就：康向东，男，主任技师，医学（内科学）博士学位，硕士生导师。现任上海中医药大学附属普陀医院检验科主任兼实验中心副主任，上海市核学会理事，上海医学会检验分会委员、上海市免疫学会第十届理事会免疫技术专业委员会委员，上海市科委2011年度“科技创新行动计划”生物医药领域产学研医合作项目专家委员会委员，检验医学编委会委员。已在美国国立生物技术信息中心GenBank 数据库注册7条新基因。主要从事自身免疫性疾病及肿瘤的发病机理、诊断及实验治疗的研究，在肿瘤标志物的筛选、抗肿瘤抗体的制备上已取得初步研究成果。曾今主持完成了国家自然科学基金项目、卫生部科学研究课题，上海市科委重点项目等多项课题研究，目前在研课题为上海市科委课题。长期从事分子生物学、免疫学和细胞生物学研究。近期发表论著30余篇，SCI论文4篇。担任系统性红斑狼疮及实用风湿病学等书的编委。带教硕士研究生5名，主要研究方向为中药在肿瘤治疗中的作用机制研究，其中一篇获得上海市中医药大学优秀毕业论文二等奖。其 他近三年内是否发生与同类技术有关的医疗事故：是（ ）否（ ）（二）学科人员学历结构总计人数博士硕士本科专科及以下30120人员情况姓名性别年龄学历职称专业从事本专业年限康向东男56博士教授免疫学12吴蓉女45本科主任技师微生物学23郑瑾女42本科副主任技师 免疫学20相芬芬女28硕士技师分子生物学3（三）项目所在科室的专用设备、设施及工作基础场所情况独立病区 个独立病床 张其他场所情况（包括专用实验室等）场所名称面积（平方米）上海临床检验中心批准的临床基因扩增检测实验室120专用设备情况设备名称型号及产地台 数必备设备全自动核酸检测工作站QIAsymphony RGQ，德国1套应有设备采血管离心机目前已开展同类技术应用情况已开展项目（具体名称）开展时间（年）工作量（例/年）手术成功率（%）生存率（%）HBV DNA12000三、开展该项技术的目的、意义和实施方案（一）目的和意义（需包括医院的总体业务量与此项技术相关医疗需求等）： 1、实施项目的意义：（1）项目背景及意义中国是乙型肝炎高发区，根据卫生部2002年统计资料显示，我国乙型肝炎的现患率为277/万，是美国的40多倍（年发病率为95/万）。流行病学调查表明，我国至少有8亿人感染过乙型肝炎，人群中的乙肝表面抗原的携带率高达10.34%，即约有1.3亿人为乙肝病毒携带者，几乎占全世界总数的一半，这些乙肝病毒携带者中的四分之一最终将发展成慢性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。全国1200多万的慢性肝炎病人中，每年死亡人数达30万之多，其中约半数为肝癌。在传统的慢性乙型肝炎治疗中，通常以HBV DNA 2,000 IU/ml作为治疗结束的标准之一，在停药以后，往往会出现病毒反跳的状况，并没有真正达到预期治疗的效果，同时也容易导致病毒变异和耐药的发生。由于受常规的HBV DNA检测灵敏度所限，无法真正反应治疗终点病人的状况。慢性乙型肝炎的治疗急需要一个更灵敏的病毒载量检测方法，用于确定治疗的终点，最大程度降低治疗后病毒反跳以及发生变异耐药的可能。（2）项目需求A. 临床需求：a) 高灵敏度HBV DNA定量检测对抗病毒治疗的预后监测：2001-2005年，不断有学者在肝病专业杂志中发表文章，指出慢性乙肝药物治疗过程中，HBV DNA浓度越低，药物更容易应答，治疗效果越好，耐药率亦更低。*Lai CL, et al. Hepatology 2005; 42(suppl 1):232A233A (Abstract 92)作者将HBeAg(+)、经LdT或LVD治疗24周时不同HBV DNA水平的患者在52周时做了四项评估，从上图可以看出：病毒浓度：24周时HBV DNA浓度300copies/ml时，在52周时有91%的病人仍然维持在300copies/ml，但是随着浓度区间的升高，在52周HBV DNA浓度能够下降到300copies/ml的病人比例却逐渐减少，尤其24周浓度高于104copies/ml的病人只有6%能够下降至300copies/ml以下；HBeAg转换：情况与24周时HBV DNA的浓度有显著相关性，浓度越低，转阴比例越高。104copies/ml时，只有约5%病人的HBeAg转阴；ALT复常：24周时浓度越高，ALT复常率越低；病毒反弹：24周时病毒浓度低于300copies/ml的病人只有1%发生反跳，随着浓度区间的上升，反跳率逐渐升高，当浓度104copies/ml时，反弹率达到14%。综合以上数据，可以看出，治疗24周时，如果病毒载量越低（300copies/ml），病人的抗病毒治疗预后效果越好。b) 高灵敏度HBV DNA定量检测在抗病毒治疗过程中对耐药突变的预防：在慢性乙肝治疗过程中最大的难题是耐药的产生，而与治疗耐药相比，预防耐药则显得尤为重要。快速抑制病毒复制至不可测水平，会有效降低耐药的发生。*Yuen MF,et al. Hepatology 2001;34(4):785-791*Locarnini S, et al. J Hepatol 2005; 42(Suppl 2):17 (Abstract 36)研究对24周病毒载量不同浓度分布的HBeAg阳性病人进行跟踪，发现在第29个月时，浓度低于检出限（200copies/ml）的病人耐药发生率只有8%，而浓度高于104copies/ml的病人发生耐药的机率高达64%。研究同时对48周病毒载量1000copies/ml分界的HBeAg阴性病人随访，发现在144周时耐药率分别为6%（1000copies/ml）。结果表明，抗病毒治疗后病人体内病毒浓度越低，发生耐药的机率越低。c) 高灵敏度HBV DNA定量检测对肝硬化及肝癌的风险评估： 2006年，一项前瞻性研究，跟踪调查了台湾地区从1991年到2004年，大约3600名HBsAg-positive的乙肝感染者，分析了HBV DNA，HBeAg， ALT等一系列指标，发现HBV DNA的水平与肝硬化和肝癌发生的风险显著相关，是最具有价值的指标，且HBV DNA水平越低，则肝硬化和肝癌风险越低。HBV DNA 基线（copies/ml）肝硬化相对风险值（n=3582)肝癌相对风险值（n=3653）3001.01.0300-9.9 x 1031.4 (0.9-2.2)1.1 (0.5-2.3)1.0-9.9 x 1042.5 (1.6-3.8)2.3 (1.1-4.9)1.0-9.9 x 1055.6 (3.7-8.5)6.6 (3.3-13.1)1.0 x 1066.5 (4.1-10.2)6.1 (2.9-12.7)1. IIoeje UH et al. Gastroenterology. 2006;130:678686.2. Chen CJ et al. JAMA. 2006;295:6573.d) 高灵敏度HBV DNA定量检测对抗病毒治疗终点的确认：2007年由美国斯坦福大学和全球多个医学院和肝病研究中心共同制订了“核苷类药物治疗慢性乙型肝炎路线图”，发表在临床肠胃及肝脏病学杂志，强调了：l 定期检测血清HBV DNA是评价治疗疗效的基础l 定义了不同治疗应答和监测时间点（完全应答为HBVDNA检测为阴性(60IU/ml)）l 高灵敏HBV DNA定量检测试剂对于治疗评估具有重要的临床价值B. 指南的更新：随着国际上慢性乙型肝炎（CHB）治疗手段和检测技术的不断发展，以及相关临床研究的不断深入，高敏的HBV DNA定量检测在治疗预后和药物疗效评价方面的临床价值被越来越多的临床医生所重视，并被相继写入了美国和欧盟的慢性乙型肝炎治疗的指南，用于指导个体化的治疗方案。在国内，越来越多的临床医生也开始重视高敏HBV病毒载量检测的临床价值。以上关于慢性乙肝治疗指南中均指出：治疗慢性乙肝的目标是持续性抑制HBV病毒的复制，直至HBV DNA水平减少到未检出（高敏荧光定量PCR法）。2、医院现有总体业务量目前我院常规乙肝DNA检测每月有800例，其中低于检测水平（500IU/ml）即当前意义的“阴性”样本约占整体样本的2030%左右，这部份样本都需要通过更高敏感性的检测试剂进行测定，以帮助判定这些样本中有多少可以满足临床指南要求。2012年6月份的中华人民共和国医药行业标准 YY-T 1182-2010 核酸扩增检测用试剂盒规定了需要使用全程参与的内标、对核酸进行提取和纯化、要求加样体积不少于20ul/反应体积不低于40ul的要求。2013年5月发布的乙肝定量检测试剂注册指导原则也明确了高灵敏HBV DNA检测试剂的检测下限不得高于30IU/ml。这些要求的提出将高灵敏度HBV检测的平台提升到一个前所未有的水平。由于新行业标准提出HBV DNA核酸需要经过提取和纯化才能够被使用，且检测下限不能高于30IU/ml ，这意味着传统的煮沸方法已不再适用。目前核酸纯化的方法主要有硅胶膜柱提取法和磁珠吸附法，这两种方法相比较煮沸法而言，操作步骤更为复杂，一方面增加了人工操作的难度，耗时较长，另一方面也容易出错并导致污染的机率增加，考虑到报告的及时性和结果的准确性、重复性，需要采用全自动方案来进行高灵敏度乙肝病毒的检测。（二）实施方案：1、从临床应用的角度而言，综合2007年由美国斯坦福大学和全球多个医学院和肝病研究中心共同制订了“核苷类药物治疗慢性乙型肝炎路线图”，2009年美国肝病研究学会（AASLD），2012年亚太地区肝病研究协会（APASL），2012年欧洲肝病学会（EASL）发布的慢性乙肝治疗指南，我室计划在以下几个节点对病人实施高灵敏度HBV DNA定量检测：l 抗病毒治疗第24周，用于判定治疗的应答情况及后续处理方案。l 对常规HBV DNA检测结果为“小于检出限”的样本进行复测，用于对病人样本进行精确定量，帮助对后续的HBeAg转换、病毒耐药、ALT复常进行预后。l 对治疗结束后的病人进行动态监测，提前预警病毒的反跳。2、从操作层面来看，以目前的标本量情况，每周开展12次检测，每次检测时，直接将病人的原始采血管离心后推送到全自动核酸提取工作站上，机器会自动进行核酸的提取及体系构建，随后人工把反应管安放到荧光定量PCR仪中进行检测。每次检测都需要带上阴性对照品、弱阳性室内质控品、强阳性室内质控品、四个定标的标准品，所有这些样品都需要经历与临床标本一致的提取和检测过程。四、该项医疗技术的基本概况（卫生行政部门公布的技术目录内的技术除外）（一）技术路线（包括技术方法、所采用的仪器设备及技术的科学性等）：1技术方法： 本项目采用磁珠法核酸纯化技术、PCR荧光探针法、内标技术，用于对临床血清和血浆中乙型肝炎病毒核酸（DNA）的定量检测。其中核酸提取采用磁珠法核酸纯化技术实现病毒核酸的提取及纯化。样本中加入蛋白酶使病毒裂解并将病毒DNA释放出来，磁珠表面包裹有一层二氧化硅，二氧化硅在高离液盐条件下特异性吸附核酸DNA，接着通过洗涤步骤有效去除二价阳离子和蛋白质等PCR反应抑制物，最后用洗脱液（低盐）将病毒DNA从磁珠上洗脱下来，完成纯化。经过纯化的病毒DNA不含蛋白质、核酸酶和其他杂质。检测分析采用临床上应用最为成熟的荧光定量PCR法。通过PCR反应扩增HBV基因组目的片段，扩增反应同时将特异性荧光探针水解而释放发光基团，通过检测及分析自由发光基团受激发产生的荧光信号可实现对HBV病毒DNA的定量检测。操作过程中，将内对照参入到每个样本中，通过内对照对整个工作流程进行监控，包括病毒核酸纯化步骤、PCR反应体系构建步骤、核酸扩增与检测步骤等，可有效防止产生假阴性检测结果。2设备：QIAsymphony SP/AS全自动样本处理工作站：可实现全自动病毒核酸纯化、PCR反应液配制及上样Rotor-Gene Q荧光定量PCR仪：实现PCR扩增3先进性、科学性： l 自动化实现核酸提取和PCR反应体系构建，减少人为误差，提高核酸纯度l 标准化的工作流程，消除了检测平台差异导致的结果偏差l 提供从样本到结果完整解决方案，实验结果实现可靠溯源l 原始样品管直接上机，节省时间l 预装试剂盒，减少人为操作，防止交叉污染l 最低检出限：20IU/ml，符合新的行业标准l 试剂盒配备内标，全程监控核酸纯化、扩增及检测，可有效防止假阴性4性能指标：l 适用样本类型：血清、血浆l 上样量： 200ull 最低检测限：20IU/mll 线性范围：40-1.1E8 IU/mll 可检测基因型：A-H，8个基因型l 精密度CV：5%l 适用平台：QIAsymphony RGQl 通量：一次运行72份检测，7小时完成144份检测结果（二）该项技术的国内外应用情况（包括该项技术在国内外的应用时间、范围、例数及获得相关监督管理部门的准入情况）l 临床基因扩增检验技术早在2009年已被卫生部列为医疗二类技术目录中，因此在中国应用已非常成熟。l 超敏乙肝检测的项目，早在2007年由美国斯坦福大学和全球多个医学院和肝病研究中心共同制订了“核苷类药物治疗慢性乙型肝炎路线图”后各大指南就已经要求乙肝检测限需实现高精度，如2009年美国肝病学会就指出：清除HBV的诊断标准其中之一，是采用敏感的PCR试剂，HBV DNA未检出；l 中国在2013年国家卫生计生委关于印发医疗机构临床检验项目目录中，就将高敏度乙型肝炎病毒DNA定量检测列入了该目录中。（三）适应症： 1. 慢性乙型肝炎抗病毒治疗第24周病毒学完全应答状态（HBV-DNA60 IU/ml）的确定：以评估抗病毒药物的疗效和选择正确的后续治疗方案。2. 慢性乙型肝炎抗病毒治疗的终点判定：依据HBV-DNA定量结果不可测（高敏PCR方法) 来判定患者停止治疗。3. 慢性乙型肝炎抗病毒治疗的预后：对常规HBV DNA检测结果为“小于检出限”的样本进行复测，用于对病人样本进行精确定量，帮助对后续的HBeAg转换、病毒耐药、ALT复常进行预后。4. 慢性乙型治疗结束后期的动态监测：及时发现低水平HBV DNA病毒的突破和反弹。现有国内传统乙肝DNA检测的试剂盒最低只能检测至500-1000IU/ml，无法真正确定治疗治疗第6个月病毒学完全应答状态（HBV-DNA60 IU/ml）和准确判定治疗终点和停药时机，从而使患者耐药及复发的风险增加。用该方法监测乙肝DNA浓度在1000IU/ml以下的病人用药后的疗效评估，确定慢性乙肝治疗达到真正终点。（四）禁忌症：无（五）不良反应：无（六）该项技术的疗效判定标准及评估方法：1判定标准： 1）内标：从提取开始向每个样本中加入大自然中不存在的、与HBV DNA目标序列相近似的一段基因序列，竞争性的参与核酸提取、纯化、加样和扩增的整个过程，监测并防止扩增结果假阴性的发生。2）室内质控：每次实验中加入相同批次的阴性对照、弱阳性质控、强阳性质控，三个质控品结果均需要符合质控体系结果要求。当其中某一个结果不符合时，需要暂停发放报告，并对实验体系进行检查与确认，解决问题后重新检测。3）室间质评：每年参加卫生部临床检验中心或者上海市临床检验中心组织的两次室间质评，结果达标2评估方法：参考上海市临床检验中心的新项目申请要求，验证包括：正确度、灵敏度、批内精密度、批间精密度、检测下限、线性范围等。1) 精密度： a) 实验方案：批内和批间精密度：取两个临床样本（5次方与3次方），实验前确认仪器运转正常，质控在控。批内精密度为一天内在仪器上重复检测20次；批间精密度为每次在仪器上检测5次，4个工作日完成，上述实验均保留原始数据，并计算SD和CV值。b) 结果判断：批内精密度10%，批间精密度CV值15%，则认为该项目达到检测要求。2) 正确度（三选一）a) 方法学比对实验方案：取20份其他医院检测过的样本，重新提取检测，将检测结果与其他医院的数据进行比较。结果判断：如果两样本检测结果对数值的差异在一个LOG值范围内，80%的样本符合则认为该项目正确度符合要求。b) 对已知靶值物质的检测（室间质评样本）实验方案：以最近两次参加卫生部临检中心或上海市临检中心EQA室间质量回报的数据为基础，对回馈的报告进行相关的数据分析。结果判断：计算上报的数据与靶值的偏倚，在规定的范围内；如果卫生部或上海临检中心回馈的报告显示相应项目状态为通过，则认为该项目正确度符合要求。c) 对标准物质进行检测（国际标准品或国家标准品）实验方案：对标准物质进行提取检测，将检测结果与标准物质的靶值范围进行比较。结果判断：检测结果在靶值的规定范围内，则认为该项目正确度符合要求。3) 线性范围（可报告范围）验证： 实验方案： 样本的选择：病人样本。 系列浓度样本：将高浓度（7次方）的样本按照1:10倍比稀释连续7个浓度（采用阴性血清稀释至6次方、5次方、4次方、3次方、100IU、40IU、20IU）每个水平重复测定3次。 样本保存条件：-20。 实验前确认仪器运转正常，质控在控，保留原始数据。结果判断：取三次检测结果的平均值进行相关性分析，相关性R20.98则认为线性通过验证。4) 最低检出限（灵敏度）验证：实验方案：取一浓度为1-5103IU/ml的样本，将样本稀释到20，40IU/ml（采用阴性血清稀释），分别检测10次，10次都能检出的最小浓度为该项目的最低检出限。（七）与同种疾病的其他诊疗技术的风险、疗效、费用及疗程比较： 当前高灵敏度HBV DNA检测项目与常规的乙肝DNA定量检测相比较如下：1、 风险：高灵敏度HBV DNA检测项目相比于常规HBV DNA检测项目而言，增加了核酸提取与纯化的步骤、增加了内标质控品、提高了自动化程度，在控制假阴性、人为误差和实验室污染等方面具有更好的风险防范措施；2、 疗效与疗程：常规HBV DNA检测的主要用途在于对抗病毒治疗前期病人体内血液中HBV DNA浓度进行测定，并在后续的第12周进行动态跟踪。在第24周的病毒监测中由于其灵敏度只能达到5001000IU/ml，无法正确给出是否达到治疗终点（60IU/ml）的评价。对于后续的预后，包括HBV DNA浓度的反跳、HBeAg转阴、ALT复常、病毒耐药预测、肝硬化及肝癌的风险预测都无法给出正确的评价。高灵敏度HBV DNA检测突破了常规HBV DNA检测的极限，可以有效判断抗病毒治疗终点并对病人的疗效和预后给出有效评估。3、 费用：目前常规HBV DNA定量检测的上海收费为80元。相比于常规HBV DNA检测试剂盒，高灵敏度HBV DNA检测试剂盒在技术上有了突破性的改进，加上自动化程度的提高，导致试剂检测成本显著高于常规HBV DNA检测。两者的技术比较见下表。目前我室仅将高灵敏度HBV DNA检测应用于抗病毒治疗第24周的