简述发酵罐连续生产液体菌种工艺

简述发酵罐连续生产液体菌种工艺连续发酵使用的发酵罐一般有电控箱，空气压缩机，煮料罐（带夹层），发酵罐（带夹层），过滤器（两套，四级），降温器，热交换器，接种枪及（空气、蒸汽、过料、出种）管道连接组成，各个管道一般用橡胶管、硅胶管、或不锈钢管连接，发酵罐大小一般为煮料罐的3倍，其使用制种技术过程以杏鲍菇为例介绍如下： 1、空消1.1、洗罐新购的发酵罐或者使用过的发酵罐，在生产之前，都必须进行彻底的清洗后方可使用。用过的发酵罐在罐体的内壁和管内所有接触液体菌种的管件表面都有可能粘附污物，洗罐的目的就是清除罐内的污垢和菌苔及培养料的残余物，疏通进气口，排料口等。1.2、利用高温高压蒸汽进行发酵系统灭菌1.2.1、清洗干净后将其密闭完成向煮料罐加水至总容积的70%-80%，打开电源开关，将温度设定到121度，在发酵罐内加水至总容积的40%，将温度设定到118-120度。1.2.2、达到设定温度后，关闭进入二级过滤器的空气总阀门，打开蒸汽总阀门，让蒸汽依次进入2、3、4级过滤器，最后进入发酵罐，对过滤器及无菌空气管道等部位进行灭菌，这时每隔五分钟左右排一次过滤器下面的冷凝水。1.2.3、30分钟后，将煮料罐出料口阀门打开少许将其灭菌。然后，打开进入过料管道的蒸汽总阀门，用蒸汽将过料管道灭菌，40分钟后（总时间）关闭进入二级过滤器的蒸汽阀门，打开空气总阀门，并将发酵罐的进气阀门关闭，打开空气压缩机，通入无菌空气吹干滤芯。1.2.4、然后，打开接种枪开关，将发酵罐出种口阀门打开少许，对其预热，然后打开进入接种枪管道的蒸汽阀门，用蒸汽对出种管道及接种枪进行灭菌，30分钟后关闭接种枪开关，用75%酒精袋密闭备用，后将灌顶接种口及呼吸器打开少许对其灭菌30分钟后关闭灌顶所有阀门，用75%酒精棉球密封接种口。1.2.5、最后，将罐内高温高压水从排污口，取样口不少于30分钟排出，当罐内压力低于0.05MPa后，打开进气阀门，通入无菌空气待罐体吹凉后保压备用。2、液体培养基制作及灭菌2.1、配方杏鲍菇发酵罐常用配方：黄豆1%，淀粉0.5%，葡萄糖1%，蔗糖2%，蛋白胨0.15%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.075%，消泡剂0.15%。2.2、配制及灭菌2.2.1、培养基装量视煮料罐大小装入总容量的70-80%。首先，将煮料罐内加水至淹没加热管3-5厘米后开始加热（水质太差需处理），黄豆提前浸泡后打浆与淀粉其他原料混合在一起，放在不锈钢或铝锅内熬成糊状母液。2.2.2、当水加热至90度时加入消泡剂，并打开供氧机吹少量无菌空气后，加入母液，并用清水冲洗进料口。2.2.3、当加热至95度时关闭供氧机，进料口向外排出大量蒸气时关闭灌顶所有阀门，将温控仪表设定到121度，将灭菌继电器设定到2400秒，打开计时开关。2.2.4、在计时期间将降温器内加满冷水降温循环管道连接好，热交换器通入循环水，当温度升到121度后，将煮料罐顶部排气阀门及进料口阀门打开一点，让蒸汽排出一些对其灭菌。2.2.5、灭菌计时结束，关闭顶部所有阀门，从罐底排污口以5-10分钟内排除300-500毫升培养基，然后打开煮料罐出料口阀门，让无菌液，通过降温器，热交换器进入发酵罐，无菌液打完后打开发酵罐进气阀门，通入无菌空气，压力调整到0.03-0.05MPa，过料管道要保持正压。当罐内培养料温度达到杏鲍菇最适生长温度24度时即可接种。3、接种及发酵培养3.1、无菌液打入发酵罐后要进行取样，检测培养料，灭菌系统是否达标，能否接种，接种前向发酵罐内通入12-24小时的无菌空气后取样，检测过滤系统是否达到无菌状态，能否接种。3.2、经检验合格后开始接种，将培养好的杏鲍菇摇瓶种子在接种前 (若是低温保藏菌种要先解冻）,用75%医用酒精将其出种铜管口浸泡10分钟以上，在火焰保护下打开接种口将摇瓶种子接入，接种时门窗要关闭以减少空气流通增加成功率。3.3、接种操作一般二人配合进行，首先，用95%酒精浸湿的火环套在接种口上，打开排气阀门，然后，用镊子拿掉接种阀门口的酒精棉球打开接种阀门，第二人手扶摇瓶，将铜管口放入火焰内，第一人用镊子拔掉管头内的棉塞，第二人将铜管插入接种口内，斜提摇瓶接入菌种，接完后拔出铜管，关闭阀门去掉火环，接种口重新用75%酒精棉球封好。3.4、完成后，打开供氧机，通入无菌空气，将温控仪温度设定到杏鲍菇最佳生长范围24度，罐压保持在0.03-0.04MPa，通气量前期1：0.3-0.5，后期按1：0.5-0.8进行深层发酵培养。培养期间要定时观察及取样检测。4、取样检测4.1、制取样培养基杏鲍菇取样培养基制作工艺流程为：A、配方（木屑79%，麦麸20%，葡萄糖1%） 拌料（将木屑与麦麸拌匀后，将葡萄糖加水融化均匀拌入，含水量55%。） 装瓶（装入250毫升盐水，料面整平压实后3-5厘米，一般200克装8瓶） 擦瓶身、瓶口 塞棉塞 包防潮纸 高压灭菌2.5-3小时 风干棉塞 冷却 检验合格后收起备用；B、250毫升空盐水擦瓶身、瓶口 塞棉塞 包防潮纸 高压灭菌40分钟 风干棉塞 冷却 检验合格后收起备用。4.2、取样杏鲍菇液体菌种连续发酵取样检测，一般接种前及接种当天与补料当天，取到空瓶内后转接到PDA培养基上进行细菌检测，接种后第1天及补料后第1天开始取到木屑取样培养基上检测菌种活力及纯度。其取样工艺流程为：将取样瓶用75%酒精浸湿棉塞，然后用10%以上双氧水或0.25%新洁尔灭溶液在处理一次，20分钟后二人配合取样，第一人手持火环点燃，第二人在火焰内从新洁尔灭瓶内拔出取样管，在火焰保护下放掉管内的残留菌液，第一人将火环套在待取样的瓶口上，用钳子拔掉棉塞，第二人将取样管插入瓶内打开取样阀放入适量液体菌种，动作要快要准，第一人迅速用棉塞封住瓶口，火环移入下一瓶，（一般每次每罐取两瓶）整个取样过程，取样管口不能离开火焰中心，取完后，把取样管口插入新洁尔灭瓶内，放回原处。4.3、培养、检测细菌检测：把空瓶内取出的样液用无菌操作技术流程接入三支空白PDA试管后，放在30-33度条件下培养48小时后没有任何异常现象及细菌污染即为合格；菌种活力及纯度检测：将取完样的杏鲍菇取样瓶放在25度条件下，培养10小时后表面菌丝发白，24小时后菌丝开始吃料，48小时后吃料0.2厘米以上，表面菌丝洁白，生长有力，72小时后没有其它杂菌，即可使用。5、补料因培养液中含有大量的颗粒状物质，在培养前期菌液较浑浊，但随着培养时间的延长，营养物质逐渐被利用，菌液变得越来越清澈。菌种培养时，在发酵罐排气口可闻到杏鲍菇的香味，而染杂菌的培养液则散发出霉臭、酒精等异味。经检测内菌丝纯度、活力、菌丝球多少和出菇能力等合格后即可补料。补料量为加料至发酵罐容积的70%-80%。补料后继续取样检测（补料方法同2）。6、发酵培养6.1、待补料完成后，打开发酵罐进气阀门，通入无菌空气，将温控仪温度设定到24度，罐压保持0.03-0.04MPa，通气量前期1：0.3-0.5，后期按1：0.5-0.8进行深层发酵培养。6.2、亦可根据生产需要通过调节温度高低，通气量大小控制培养时间的长短，培养期间要认真观察菌种的生长速度，菌液、PH值的变化及发酵罐是否正常工作等生产细节。6.3、当罐内菌丝球密度达到视镜70-80%左右时，且培养液清澈，菌丝球较小并均匀，在发酵罐排气口可闻到杏鲍菇的香味无霉臭、酒精等酸臭异味即可用于接种生产。7、不接种连续发酵培养7.1、连续发酵培养是在培养好的液体菌种接种生产时，在罐内留下5-15%左右液体菌种，作为母种，用补料的方法打入新的液体培养基，继续培育新的液体菌种。7.2、经生产验证一次接种后如不染菌，不换品种连续发酵培育3-6个月不用再次接种，培育出的依旧是优质菌种。7.3、为确保连续发酵成功率，最好每3-5天过滤器、10-15天接种管道，接种枪灭一次菌，具体方法与【空消】类似、空气压缩机2-3天、一级过滤器1天排污一次。7.4、若几个发酵罐生产的是同一个品种，它们的菌种或料液是可以相互补充的，如需更换品种，用同【空消】一样的方法，对发酵系统进行灭菌，然后打入新的培养料，接入新的菌种即可。8、个人观点8.1、液体菌种使用应注意8.1.1、液体菌种是悬浮在发酵罐内液体培养基中的单个菌丝球组成，具有菌龄一致，渗透性强，萌发早，吃料快等优点，但它不能长期存放，不适应异地运输，现做现用效果最好。8.1.2、其接入料袋后菌丝与固体料直接接触，适宜的环境能加快吃料速度，提高成品率；反之影响菌丝生长；一般PH值偏高或偏低，培养料含水量过大都会影响菌丝生长，所以接液体菌种的培养料含水量比常规要低5-10%，PH值要在最适范围。8.1.3、接种后要在最佳温度下培养，以利于菌丝尽快萌发定置，增强其抗杂能力，降低污染几率。8.1.4、接种后每个菌丝球都暴漏在固体培养料表面，没有任何缓冲保护，所以搬动时要轻拿轻放，不要损伤菌丝，以免影响萌发。8.2、选择液体培养基时应注意8.2.1、注意碳氮比的协调，氮源过多会引起菌丝生长过于旺盛，不利于代谢产物的积累。碳源不足，又容易引起菌体衰老和自溶，碳、氮比不当，会影响菌丝按比例地吸收营养物质。8.2.2、同一种原料因产地不同其营养成分有差异，这在氮源表现得较明显，如大豆、玉米浆、蛋白陈等，必须记下每一种原料的产地、批号、生产厂等，并对原料进行化学成分分析。8.2.3、水质对发酵生产的影响也很大，自来水、地表水、河水、井水、雪水等，其中所含溶解氧、金属离子及酸碱度等均有差异。另外，有的水中还含有较多的氯离了。因此应对水质进行化学分析，以饮用水质为标准进行选择。8.2.4、高温(或高压)灭菌会引起某些营养成分的破坏，特别是还原糖、氨基酸和肽类等共同加热时，会形成与羟甲基糠醛及类黑精等物质。赖氨酸最容易与糖发生反应，形成棕色物。8.3、工厂化应用液体菌种应注意8.3.1、要选用专门适合食用菌菌丝生长的发酵设备，另外空气导管要便于拆卸清洗，最好采用耐高温透明塑料来替代钢管，便于发现污渍，罐体内的可视性尽可能强些。8.3.2、在液体菌种生产上思想要高度重视，不抱侥幸心理，需制定严格的食用菌菌丝液体发酵无菌操作规程，并配备发酵所要求的环境设施，同时，摈弃液体菌种生产很简单、谁都可以操作的错误认识，必须配备具有较高专业素质的操作人员来进行生产。8.3.3、运用液体菌种接种时，要制定适当的接种量，并严格控制接种量。接种量大或小了在培养阶段液体菌种的优势体现将受到影响，甚至会转化为劣势。8.3.4、食用菌菌丝与发酵工业的大多数微生物相比较，生长势更弱，对养分的竞争力差，许多工业发酵菌种相对于食用菌菌种来说，都是具有强势竞争力的杂菌，在同样发酵条件下，食用菌发酵更易污染。一两次生产出来不能代表什么，工厂化是要连续、稳定地成功生产，污染率能够受到控制，这需要提供许多配套设施和条件来保证。另外，要严格做好液体菌种检测及异常情况处理方案，以防液体菌种污染导致后续工作进展受阻。8.3.5、据了解，液体菌种的使用，能使食用菌生产周期至少缩短30 d， 生产设施总投资减少20%-30%，将颠覆原有整个落后的生产模式。液体菌种替代固体菌种来生产食用菌，虽然目前仍有许多困惑要搞清，很多问题与困难要解决与克服，但这是行业发展的总趋势，是该产业生产工艺换代的需要与技术飞跃的必然前进方向。8.4、应用发酵罐连续生产液体菌种应