1DNA重组技术的基本工具(王凯辉).ppt

生物选修3现代生物科技专题,目录,专题1基因工程专题2细胞工程专题3胚胎工程专题4生物技术的安全性和伦理问题专题5生态工程,专题1基因工程,是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,一、基因工程的概念,由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，产生人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,二、基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译,二、基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译,技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。,普通棉花抗虫棉,1.1DNA重组技术的基本工具,想一想：需要做哪些关键工作？,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,1.1DNA重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,从苏云金杆菌细胞内提取出抗虫基因,关键步骤二：,抗虫基因与运载体DNA拼接,关键步骤三：,抗虫基因导入受体(棉花)细胞,1.1DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具“分子手术刀”DNA片段的连接工具“分子缝合针”基因转移工具“分子运输车”,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,DNA重组技术的基本工具,思考：,1.在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？2,现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一种稳定状态？,原核生物细胞中的限制酶会将外源DNA切割掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身的DNA，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。,3.怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？,限制酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现.后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制酶破坏.修饰酶识别的位点与限制酶识别位点相同,但只甲基化每条链中的一个碱基,而不是切开DNA链,甲基化的DNA无法被限制酶作用.注:限制酶与修饰酶在不同的情况下,可能是两种不同的蛋白质,也可能是同一蛋白质的不同功能部位.,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,来源：,主要从原核生物中分离纯化出来。,种类：,已从近300种微生物中分离出约4000种限制酶。,作用：,1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,磷酸二酯键：,具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，,作用特点：,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,限制酶的识别序列：,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,形成两种末端,EcoRI限制酶的切割：,SmaI限制酶的切割,1.大肠杆菌的一种限制酶（EcoR）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。2.Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,黏性末端,平末端,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，Sma识别CCCGGG序列:,磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸之间的连接,切割DNA分子时产生的两种不同末端,限制酶切割DNA后形成的末端黏性末端、平末端是如何形成的？,思考：,什么叫黏性末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,切割位点,和之间,和之间,未端类型,平末端,黏性末端,4、切割后的形式：2种末端,注：1.限制酶是一大类酶，不是一种酶。2.限制酶大多可以专一性识别双链DNA分子上的某种特定核苷酸序列，限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的。3.如果所识别的序列是奇数如5个碱基,则中轴线在中间的碱基对上,除了中轴线外,两侧的双链DNA上的碱基是反向对称,1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,3.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,2.切下的特定片段上有几个黏性(平)末端?如果直接用DNA连接酶连接会出现什么情形?,两个黏性(平)末端;会出现自身环化现象,4.如何避免自身环化现象?,分别用不同的限制酶切割两个部位,这样就不会出现相同的黏性(平)末端.,思考与探究,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,二、DNA连接酶“分子缝合针”,二、DNA连接酶“分子缝合针”,1、作用：,形成磷酸二酯键,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,2、类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,二、DNA连接酶“分子缝合针”,DNA聚合酶,将外源基因送入受体细胞。,载体的作用：,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,作为载体的必要条件：,有切割位点供外源DNA片段(基因)插入。能自我复制并能带着插入的目的基因一起复制有遗传标记基因供重组DNA的鉴定和选择。载体DNA必需是安全的不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。载体DNA分子大小应适合以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,质粒：,裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,质粒,质粒：,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,说明没有危害，大肠杆菌是非致病菌，且分裂快，也便于从大量复制个体中分离出来。,质粒噬菌体的衍生物动植物病毒等,载体的种类：,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,小结,随堂练习,1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,答案：C,2.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作