RNAi和siRNA转染

RNAi和siRNA转染的内容，第一部分RNAi实验的基本概念，第二部分RNAi实验的具体设计，第三部分siRNA转染过程中的相关问题及解决方案，第一部分RNAi实验的基本概念，主要内容，1。RNAi概念2。RNAi启动途径3。非哺乳动物系统中的RNAi实验。哺乳动物系统中的RNAi实验。RNAi影响性能。1.1的概念。核糖核酸干扰(RNAi)，核糖核酸干扰(RNA interference)是双链核糖核酸(dsRNA)特异性结合到与其序列互补的信使核糖核酸上，导致信使核糖核酸降解，从而介导转录水平的基因表达抑制。2006年，安德鲁菲尔和克雷格梅洛共同获得了诺贝尔生理医学奖，他们发现了“核糖核酸干扰机制双链核糖核酸沉默基因”。2。RNAi起始途径，(1)dsRNA途径，(2)siRNA途径，(3)shRNA表达载体途径，(1)dsRNA途径，dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞并被细胞内双链特异性核酸酶Dicer水解为21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi。然而，在绝大多数哺乳动物系统中，dsRNA超过30bp将导致细胞潜在的抗病毒机制(干扰素效应)降解dsRNA。(2)siRNA途径，小干扰核糖核酸，21-23bp长，双链。作用机制：双链siRNA断裂并组装成核糖核酸介导的沉默复合物。siRNA的反义链引导RISC和信使核糖核酸分子互补结合并降解信使核糖核酸，最终导致特定基因表达的抑制。(3)shRNA表达载体途径。shRNA在细胞中表达后，在Dicer的作用下形成shRNA分子，产生RNAi。可能是细胞毒性的。shRNA可能通过竞争Exportin-5导致致命毒性。3.在非哺乳动物系统(如线虫和果蝇)中进行的RNAi实验不涉及抗病毒免疫反应，可以通过与靶基因序列互补的长链dsRNA(通常为200bp)介导RNAi。长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。长链dsRNA进入细胞后可被双酶水解成多个混合siRNA，敲除效果更好。4.哺乳动物系统的RNAi实验，通过转染siRNA:一般来说，高基因表达抑制效应可以维持3-7天，而效应期的长短主要取决于细胞增殖速度和siRNA的有效性。大多数RNAi实验的结果可以在这个时间段内获得，并且通过再转染可以获得超过1周的基因表达抑制时间。通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表达抑制时间。在长期的RNAi实验中选择shRNA表达载体更合适。RNAi效应的表达，由RNAi效应引起的靶基因的下调可以在信使核糖核酸水平和蛋白质水平上表达，也可以在生理方面如细胞形态上表达。第二部分是哺乳动物系统的RNAi实验设计。主要内容有：1 .需要短期抑制还是长期抑制？2.用siRNA 3进行实验的方法。实验4 SHRna表达载体的构建。siRNA设计中需要注意的问题。目标缺失效果6。转染是RNAi实验的瓶颈。需要短期抑制还是长期抑制？1周内，siRNA更好，不需要构建载体，节省时间，通过两次转染的方法可以将RNAi作用时间延长到2周。在持续2周以上的长期RNAi实验中，shRNA表达载体更好，效果持续时间更长。(2)化学合成：优选的siRNA制备方法是最快、最方便和成本最高的，并且适合长期使用的特定siRNA(2)体外转录：耗时、成本低和所需有效浓度低。三种适用于筛选sirnasilencersrnaconconstructionkit(thermo fisher)(3)非哺乳动物系统的二聚体/RNase酶水解的RNAi方法可被荧光标记，以便转染效率可及时得知；3.用于实验的shRNA表达载体的构建需要构建相关的质粒，其可以通过使用载体上的标记物如抗生素来筛选。不能用荧光标记长期表达，也不能直观地知道转染效率。4.siRNA设计中需要注意的问题，(1)siRNA序列设计，(2)阴性对照的作用，(3)阳性对照的重要性，(4)siRNA荧光标记问题，(1)siRNA设计如果可能的话，再设计几个siRNA序列来筛选最特异和有效的siRNA序列。(2)负控制siRNA效应。阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起基因表达的任何变化，因此反映了小分子核糖核酸片段在进入细胞后对基因表达的非特异性影响。(3)积极控制siRNA的重要性。阳性对照siRNA使用siRNA，这被证实是有效的，并针对一些更容易检测的基因，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因。它用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法的可行性等。阳性对照siRNA在RNAi实验的早期或在新的转染系统中进行RNAi实验时非常重要，容易被忽略。缺乏积极的控制siRNA使得不可能找到实验中问题的原因，并拖延了时间。(4)siRNA荧光标记问题。使用荧光标记的siRNA可以用于确定转染效率和优化转染条件。该方法操作快速，实验成本不高。然而，由于荧光标记的siRNA的摄取和siRNA引起的抑制作用通常是不相关的，这种情况在一些细胞系中和当应用一些转染试剂如脂质体时更为严重。因此，在使用脂质体转染试剂优化转染条件时，不建议使用荧光标记的siRNA。(1)什么是5。目标效应？(2)如何检测脱靶效应？(3)3)siRNA浓度与脱靶效应相关吗？(4)转染试剂是否也会导致靶效应缺失？(5)如何避免遗漏效应？(1)什么是1)负靶效应？RNAiOff-target(脱靶效应):简而言之，它是siRNA转染中的非特异性反应，它不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身的非特异性表达变化或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因的影响，从而导致假阳性和假阴性。目前，研究人员对此非常重视。(2)如何检测脱靶效应？多种方法可以用来预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片法。(3)3)siRNA浓度与脱靶效应相关吗？以前，人们认为高浓度会产生脱靶效应，但事实上低浓度也会产生脱靶效应。(4)转染试剂是否也会导致靶效应缺失？有些人用基因芯片来检测转染试剂对细胞基因表达的影响。发现脂质体L2K可引起1908基因表达变化，包括下调和上调。如果转染试剂本身引起某一基因表达的上调，则在siRNA被转染后该基因的表达可能不变或甚至增强，从而引起假阴性现象，并且如果转染试剂本身引起某一基因表达的下调，则可能发生假阳性现象。(5)如何避免遗漏效应？脱靶效应不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应。例如，可以为同一个目标基因设计两个或两个以上不同的抑制效率大于70%的siRNA序列，并且可以分别进行实验以避免siRNA引起的遗漏效应。用不同的转染试剂进行实验可以避免转染试剂引起的脱靶效应。转染是RNAi实验的瓶颈。转染是siRNA实验的瓶颈。转染的质量直接关系到RNAi实验的成败。(1)转染方法的选择原则(2)siRNA转染法(3)siRNA转染试剂的主要类型(4)脂质体(5)非脂质体聚合物，(1)转染方法的选择原则，转染效率高：转染效率越高，抑制效果越好，更有利于观察实验结果；低细胞毒性：由于RNAi是一种抑制性实验，转染试剂的毒性导致细胞凋亡等结果。这一结果严重干扰了细胞的正常生理功能(主要表现为抑制)，细胞不能进行正常的转录和表达，并发生凋亡。转染试剂的毒性不仅干扰细胞的正常生理状态，而且可能影响实验结果。方法简单，操作简单：实验过程越简单，操作越少(2)siRNA转染法。迄今为止，转染方法主要采用化学方法，对于化学方法不能转染的，采用电转化等物理方法。(3)主要类型的siRNA转染试剂，脂质体非脂质体聚合物，(4)脂质体，早期开发的，主要开发用于大分子如转染的质粒DNA，现在也改进用于siRNA转染；它适用于siRNA和质粒的共转移以及一些低毒性要求的siRNA转染。代表性产品包括来自invitrogen的lipofectamineTM2000/3000和RNAiMAX。(5)非脂质体聚合物，为了克服脂质体转染试剂的毒性和提高转染效率，现已从高分子转染试剂发展到纳米聚合物转染试剂。代表性产品包括：默克公司的纳米果汁转移工具包(Caco-2)；Qiagen s HiperFect；XfectTM克隆技术公司；微孔-微孔的转移剂；工程师和生物系统工程师等。第三部分，siRNA转染过程相关问题及解决方案，1.siRNA转染过程相关问题2.siRNA转染问题解决方案，1.siRNA转染过程相关问题，(1)转染细胞数，(2)转染过程中siRNA工作浓度，(3)转染过程中血清，(4)转染过程中抗生素，(5)转染过程，(6)转染后液体交换，(7)转染条件优化，(8)RNAi效应检测方法，(1)转染细胞数，细胞数：转染过程中细胞融合率宜为20%-40%。这种收敛程度小于正常的DNA转染，因为转染后的培养时间通常比DNA转染的时间长，并且较低的细胞数也有利于提高抑制效率。应该注意的是，转染过程中细胞的聚集程度(细胞数量)对RNAi结果有一定的影响。为了降低转染试剂的毒性，一些转染试剂，如脂质体，需要更高程度的收敛。一般来说，较少的细胞可以提高抑制效率。(2)转染过程中的siRNA工作浓度和siRNA浓度：应根据具体实验进行相关优化。低siRNA浓度不能达到相应的抑制效果，而高siRNA浓度可能引起一些非特异性变化。应当注意，这里的siRNA浓度是指反应时的最终siRNA浓度，即基于转染时细胞的总体积计算的浓度。通常，siRNA的有效反应浓度在10纳米和200纳米之间，并且选择最低有效浓度。应当注意，对于21nt双链siRNAoligo，siRNA的分子量约为13，300 g/mol。合成siRNA的OD值与nmol之间的换算关系受产品中其他成分的影响，如荧光标记、纯度等。有关详细信息，请咨询合成公司，一般为1 dDuplex2.5-5 nmol33-66ug。(3)转染过程中的血清问题。一些转染试剂要求在转染前更换无血清培养基，在转染后4-6小时更换无血清培养基，这实际上是为了降低转染引起的细胞毒性。现在更好的转染试剂也可以在有血清的情况下被转染。(4)转染过程中的抗生素问题。一些转染试剂，如脂质体，在转染过程中需要使用无抗生素的培养基。这是因为培养基的一些成分，包括抗生素，在脂质体转染过程中也被带入细胞，导致细胞毒性。现在更好的转染试剂不需要去除抗生素。(5)转染过程：转染过程实际上非常简单。通常，将转染试剂和siRNA分别稀释，然后将二者混合，滴加到细胞表面，然后继续培养细胞。这可以根据不同转染试剂的方案来完成。(6)转染后液体变化的问题。一些转染试剂需要在转染后4-6小时换液。目的是去除培养基中的游离转染试剂并降低细胞毒性。(7)转染条件的优化。转染条件的优化不仅是为了获得最高的基因抑制效率，也是为了降低转染条件对细胞的毒性。优化方面主要包括：转染试剂的用量、siRNA、转染过程中的细胞密度蛋白质水平：蛋白质印迹、免疫荧光检测和流式细胞检测是常见的。可以在48小