搜风祛痰法的中药对Ang

搜风祛痰法中药对Ang诱导人脐静脉内皮细胞NF-KBmRNA及iNOSmRNA表达的影响赵增成一、宫丽鸿一、高峰二、刘丹二、高冬梅二、杜玉杰二(辽宁中医药大学，辽宁沈阳，110032 )目的：观察搜风祛痰法对血管紧张素体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NF-KB mRNA和iNOSmRNA表达的影响，阐明搜风祛痰法中药调控NF-KBmRNA和iNOSmRNA在AS过程中的可能性作用机制。 方法：制备兔活心汤的含药血清。 采用酶消化法培养HUVECs2-3代，采用RT-PCR法测定内皮细胞NF-KBmRNA和iNOS mRNA，随机分为5组：正常对照组、angii组、低浓度中药血清angii组中浓度中药血清angii组高浓度中药血清angii组。 结果活心汤能抑制Ang对内皮细胞的损伤，减少NF-KBmRNA及iNOSmRNA的表达。 结论活心汤能抑制Ang对HUVECs的损伤，保护血管内皮功能。【关键词】血管紧张素内皮细胞； NF-KB； iNOS； 搜风祛痰活汤效果ofesperingwindtoeeliminatephlegmontheestityofvascularendotheelialcellsfn-kbmrnandinosmrnainducedbyangiotensin赵天城1，替李洪1 *，高智能2，高智能2，杜玉- 2(Liao-ninguniversityofchinesemedicine，生杨(110032 )，China.)methods : thesermumcontingmetabolicingredientsofhuoxindecoctionforrabbit.Hu vecs2-3perialculturedinvitrobycollagenasedige siver osmrna是rt-PCR method.huvecoverandlydivideintofigmgroups:normalcontrolgroup ang ii group，lowconcentrationdrugserumandangigroup， mintconnectrationdrugserumandangigroupandhigconnectrationdrugserumandangigroup.results:huoxindecoctioncouldinhibittheinury off ecreasetheexpressionofnf-kbmrnandinosmrna.conclusion:huoxindecoctioncouncilinhibittheinuryofhuvecsinducedbyangiotensinitoproperKey words: Angiotensin ； endothelial cells； NF-KB mRNA； iNOSmRNA； expelling wind to eliminate phlegm； Huoxin Decoction基金项目：沈阳市科技基金项目(No.1071215 )作者简介：赵加成男辽宁省大连市人辽宁中医药大学硕士课程tel:5398285355e-mail:通信者：宫丽鸿女辽宁中医药大学附属医院主任医师教授医学博士研究生导师tel :53525252525252525352535253525352535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353535353.动脉粥样硬化(AS )是动脉粥样硬化常见的重要一种，是心脑血管疾病的重要病理基础。 受影响的动脉病变始于内膜，前后并发存在多种病变，局部存在脂质和复合糖类积累，出血和血栓形成，纤维组织增殖和钙沉积，动脉中层退化和钙化。 因为动脉内膜积蓄的脂质的外观是黄色粥样的，所以被称为AS【1】。 AS是一种特殊的慢性炎症过程，与内皮细胞损伤和功能异常密切相关。 近年来心脑血管疾病的发生率逐渐升高，趋于年轻化，严重影响着人类的生活质量。 本实验目的通过观察搜风祛痰法中药对血管紧张素诱导血管内皮细胞NF-KB mRNA及iNOSmRNA的影响，为AS的治疗提供一定的理论基础，期待临床药物的指导。1实验材料1.1药物活心汤：蝎子15g、蜈蚣2株、地龙20g、陈皮15g、半夏15g、白术15g、蛭15g由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工含中草药的2g/ml中药浓缩液保存在4 冰箱中。 中所述情节，对概念设计中的量体体积进行分析1.2动物健康新西兰大耳白兔(辽宁中医药大学动物实验中心)的清洁班级，不分雌雄，体重为2.0-2.5kg1.3实验设备高速冷冻离心机(Sigma 3C15K美国)超清洁工作台(苏州净化公司) CO2恒温孵化器(THEROM HERAce11150 )倒立显微镜(奥林巴斯ix71) PCR计(biomeraunioii型，德国)紫外分光光度计(UV-3000，英国)凝胶自动成像1.4所需制剂Ang(美国Sigma公司)胰蛋白酶(Gibco公司) DMEM (美国Gibco公司) PCR引物(北京华大基因公司合成)胎牛血清(天津市电洋生物制品技术有限责任公司)2实验方法2.1药物血清的制备将兔随机分为4组：低剂量组(n=5)中剂量组(n=5)高剂量组(n=5)分别给予活心汤，以人临床剂量动物等效计量比血清稀释度为参考给予剂量，空白对照组(n=5)给予相同容积的蒸馏水，连续5天，第5天胃2 h (禁食12 h，不禁饮水)颈动脉出血，分离血清，56灭活30 min，低温干燥，保存至-80，暂用DMEM培养液2.2 HUVEC培养和鉴定人脐静脉内皮细胞的传代：原代培养的人脐静脉内皮细胞生长至80%以上合流时，倒出培养液后用PBS液洗涤2次，然后加入少量的0.2%胰蛋白酶消化，约2分钟后用倒置显微镜观察，发现细胞萎缩或相互分离， 看到出现大的分离表示内皮细胞脱壁，然后加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液中止消化，用吸管反复喷射瓶壁制作细胞悬浊液，用计数板计数后，以1105个/ml分注到25cm22.3实验组随机分为5组：正常对照组(空白血清) ang组(0.5mol/L )低浓度中药血清ang组： 0.5mol/L Ang 2.5%中药血清； 中浓度中药血清Ang组： 0.5mol/L Ang 5%中药血清； 高浓度中药血清Ang组： 0.5mol/L Ang 10%中药血清。 用中药血清预先孵育2h后，加入Ang0.5mol/L刺激2h，收集细胞。2.4 RT-PCR法测定内皮细胞NF-KBmRNA和iNOSmRNA用Trizol试剂一步提取组织总RNA，用紫外分光光度计测定纯度并定量。 根据中国医科大学提供的NF-KB、iNOS和内参照-actin的mRNA序列，用软件Primer Premier5.0设计了引物。 序列如下所示引物上游引物下游引物扩增长度nf-kb5-gccgaagaagacctatccc-3-ctcatagaaccacctcaa-3575 BPino S5-ggagcgtaacaagga-3-gccagcatagcggatg-3310 BP- actin5- aaatcggcgtgaattaa-35-ctcgtcatacttgcttc-3472 BP反应条件： 94 5min、1个循环94 30s、59 30s、72 1min、35个循环； 72 5min后终止扩增反应。 将5lPCR产物与2l Lodding Buffer混合，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V 1.5小时电泳结束后凝胶成像仪图像分析。2.5统计学处理：SPSS12.0软件，所有数据采用s，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，相关分析采用线性相关。 检测水平=0.05，P0.05存在统计学差异。3结果RT-PCR结果定量分析：采用FlourChem V 2.0凝胶图像分析软件(America )分析，记录各蛋白质电泳带的灰度值，进行定量分析3.1活心汤诱导血管紧张素表达血管内皮细胞NF-KB mRNA的影响正常对照组nfkbmrna表达最低，AngII组nfkbmrna表达明显高于其他4组(P0.05 )。 3个中药血清组NF-KBmRNA表达明显低于AngII组(P0.05 )，中高浓度中药血清组比低浓度组中药血清抑制NF-KBmRNA表达(P0.05 )，中高浓度中药血清组之间无显着差异(P0.05 )。 结果示于图1及表1M 1 2 3 4 5战斗机图1血管内皮细胞NF-KB mRNA表达表1注： M- Mark； 1-正常对照组2-AngII组3-低浓度组4-中浓度组5-高浓度组。3.2活心汤诱导血管紧张素表达血管内皮细胞iNOSmRNA的影响。正常对照组iNOSmRNA表达最低，AngII组iNOSmRNA表达明显高于其他4组(P0.05 )。 3个中药血清组iNOSmRNA表达明显低于AngII组(P0.05 )，与低浓度组中药血清相比，中高浓度中药血清组抑制iNOSmRNA表达(P0.05 )，中高浓度中药血清组之间无显着差异(P0.05 )。 见表2和图2。表2图2 AngII及不同浓度中药刺激后iNOSmRNA的表达注： M-Marker、1空白组、2AngII组、3低浓度中药组、4中浓度中药组、5高浓度中药组、-actin为内参。4讨论动脉粥样硬化斑块的形成是一个复杂的过程，始于内皮功能障碍。 这种功能障碍包括增加内皮对载脂蛋白等的渗透性，包括血管平滑肌的移动、t细胞的活化、泡细胞的形成、血小板附着的聚集。 在AS这一炎症性增生性疾病的病变部位，血管平滑肌、血管内皮细胞、巨噬细胞内存在nf1kb的活化现象，由此引起细胞粘附、炎症性细胞的趋化、细胞分化和细胞外基质的分解，参与促进AS的进展【4】。NF-KB是基因多显性转录因子，调控着细胞黏附分子、细胞因子、生长因子和部分凝血系统成分的基因表达，其激活与炎症反应、动脉硬化等疾病密切相关。 核转录因子NFKB是许多信号转导环节的集合点。 并诱发炎症因子细胞因子、黏附分子和单核细胞趋化因子高效表达作为炎症通道的重要转录因子，在动脉粥样硬化早期炎症病变的形成和发展过程中发挥重要作用的是目前筛选中药复方处方中最潜在的抗炎靶点【7】。NO是炎症性介质之一。 所有血管要发挥正常功能，NO必须达到基础水平，但NO过度发生则介导炎症反应。 NO的过度发生取决于iNOS mRNA的异常表达。 机体对NO的作用调节是通过调节不同NOSmRNA子类型的表达，产生不同的NOS子类型来实现的。 NOS包括iNOS和构成型一氧化氮键(cNOS )，cNOS包括内皮型NOS(eNOS )和神经型NOS(nNOS )。 iNOS多存在于各种器官的巨噬细胞Kipffer细胞中，也少量存在其他类型的细胞。 来自iNOSmRNA的NO作用以细胞毒性为主【8】。 细胞毒素如脂多糖、细胞因子等激活iNOS，产生比正常多1万倍的【9】。 iN0SmRNA的半衰期比较长，如果被激活的话，iNOS【10】会被长时间翻译合成，iNOS被诱导合成的话，直到基质消失【11】为止，会持续产生大量的NO。动脉粥样硬化在中医学上并无此病名，根据本病的临床表现和病理变化，本病可归属于“脑卒中”、“胸痛”、“坏疽”等病症范畴，是临床上胸痛常见病症之一。 胸痛首次见于黄帝内经、灵枢本脏云。 【12】痰饮阻痹胸是胸痛的主要病机，如果肺大，饮用过量，病情会