制药工程原理

1、生物技术制药有什么特点？(1)高新技术制药的高新技术性主要表现为高知识水平的人才和高新技术手段。 生物制造是知识密集、技术含量高、多学科高度综合渗透的新兴产业。(2)高投入生物制药是相当大的产业。(3)从长周期生物药物的开发到最终转化为产物，必须经过多个环节：实验室的研究阶段、试制阶段、临床试验阶段规模化生产阶段的市场商品化阶段、药政审查过程。(4)高风险的生物医药是一个巨大的系统项目，无论在哪个阶段失败都会放弃以前的工作。(5)高收益生物技术可以用大量廉价难产药物满足患者的治疗需求，具有巨大的社会经济效益。2、基因工程制药中质粒的不稳定性是如何发生的，如何提高质粒的稳定性？质粒不稳定分裂不稳定，结构不稳定。 质粒分裂不稳定是工程菌分裂时不含质粒子菌以一定比例出现的现象，影响因素：是含质粒子菌发生不含质粒子菌的频率，质粒的丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关，第二质粒的结构不稳定性是由于dna从质粒上消失、碱位错或缺失而引起的工程菌性能的变化，质粒的自发缺损与质粒中短前向重复序列之间的同源重组有关，在两个被动部位之间也发生缺损方法：选择合适的宿主菌，选择合适的载体，选择压力，逐步控制培养，固定培养条件在基因工程的制药过程中，如何获得目的基因，至少可以介绍三种方法吗？方法：逆转录法、逆转录聚合酶链反应法、化学合成法。逆转录：从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以克隆编码某特异蛋白肽的dna序列为模板，利用逆转录酶逆转录合成该蛋白质mRNA的互补dna，以cdna第一链为模板，反转录酶或dna聚合物逆转录法：mRNA的纯化cDNA第一条链的合成cDNA第二条链的合成cDNA克隆将重组体导入宿主细胞cDNA文库的鉴定7目的cDNA克隆的分离和鉴定。逆转录聚合酶链反应法： mRNA被逆转录合成cDNA的第一链，不需要再合成DNA的第二链，特异引物协同合作，用PCR法放大，特异合成目的cDNA链重组用于克隆。化学合成法的缺点：小分子蛋白和多肽的编码基因可以人工化学合成。 化学合成法需要了解蛋白质的氨基酸序列，前提条件是从适当的密码子中导出DNA的核苷酸序列。4、基因工程制药表达宿主细胞的受体有哪些？ 你有什么优点和缺点？基因表达的微生物宿主细胞：原核生物，常用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链球菌。 真核生物，常用的是酵母菌、丝状真菌。(1)大肠杆菌：细胞内不溶性表达、细胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少时分泌到细胞外。 缺点：提取困难，真核蛋白多形成不溶性包容体，蛋白产物不能糖基化，大肠杆菌不易产生内毒素，也会产生蛋白酶破坏目的蛋白质。(2)枯草芽孢杆菌：分泌能力强，具有将蛋白质产物直接分泌到细胞外，不形成包容体的优点。 缺点：蛋白质产物不能糖基化，具有较强的胞外蛋白酶，在一定程度上降解产物。(3)链球菌：具有非病原安全、分泌能力强、表达产物可直接分泌到培养液中、糖基化能力强的优点的铅蓝链霉菌修饰能力弱，构建一系列可作为理想受体的有效载体的下游培养技术已经成熟。(4)酵母：基因组小，世代时间短，有多倍体、多倍体两种形式。 繁殖速度快廉价，无毒性。(5)丝状真菌：具有较强的蛋白分泌能力，可准确进行翻译后的加工、糖基化，具有成熟的发酵和后处理技术。为什么要试制生物技术制药？ 基因工程制药应考虑哪些因素？中试可以为临床试验提供大量产品，也可以将中试获得的数据作为生产设计时的参考。问题：考虑适合商品化生产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过程、发酵培养基成分，选择维持生产工艺优化的方法，工艺检验方法，工艺控制方法，工艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品提取方法，选择分离纯化技术。6、在基因工程制药过程中，如何实现高密度发酵？ 以原核表达为例。 “这是发酵工程的制药，我想说，但是好像不会说，希望自己学习，基本要点是书的43-44页，从41页可以看到。”改善发酵条件：培养基的选择：尽量选择容易被工程菌利用的营养物质，高密度发酵培养基的碳源采用6g/L甘油，高密度发酵培养基各成分的浓度也比通常培养基高23倍，满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求建立流加式培养方式：一般采用指数流加的方法。 提高供养能力：小型烘箱即使是空气和纯氧混合通气的方法，也可以通过提高烘箱压力的方法向发酵液中添加过氧化氢，细菌在细胞过氧化氢酶的作用下释放氧气自己使用。构建乙酸产生能力低的工程宿主菌：分流阻断乙酸产生的主要途径，碳代谢流，限制进入糖解途径的碳代谢流，导入血红蛋白基因。构建蛋白水解酶活性低的工程化宿主菌：培养大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株7、基因工程药品的质量控制是什么？(1)生物材料质量控制主要包括目的基因、表达载体和宿主细胞的检测。目标基因应明确目标基因的来源、克隆过程提供载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分的来源和功能宿主细胞应具有宿主细胞的名称、来源、传代的历史、 提供了一种基因和插入表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，在生产过程中需要证明载体在宿主细胞和载体结合后的遗传稳定性，以及将必须提供鉴定结果和生物学特性的载体导入宿主细胞的方法和载体在宿主细胞内的状态培养过程的质量控制是工程菌贮藏中要求种子克隆纯稳定的培养过程，在工程菌中质粒稳定、无突变的反复生产过程中，工程菌表达稳定，可以排除外来微生物污染。生产用细胞库基因工程产品采用种子库系统，证明种子库不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌、支原体等污染，用原始种子库建立生产用作业细胞库的原始种子批需要证明克隆基因DNA序列， 阐述了种子批次的来源、方式、保存和使用时间，阐述了种子在保存和复苏时的稳定性，阐述了所生产的种子细胞在产品中的生长方式和材料，提供了必须抑制微生物污染的培养产量和产量的定性数据，根据宿主细胞、载体系统的稳定性确定了最高允许遗传代数。 培养过程、培养过程通过宿主细胞、载体稳定系统和产品稳定性测定表达的基因分子完整性和宿主细胞长期培养后的基因型特征，规定持续培养时间，定期评价细胞系统和产品。 培养周期结束后，应检测宿主细胞、载体系统的特性。精制过程中的质量控制产品具有充分的生理和生物学试验数据，必须保证精制分子批次之间的整合性，DNA和热源质量控制在规定限度以下。目标产品质量控制基因工程药物质量控制主要包括：产品鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性生物活性鉴定理化性质鉴定：非特异性鉴定、特异性鉴定、相对分子质量鉴定、等电点测定、肽图分析、氨基酸组成分析、部分氨基酸序列分析、蛋白质二硫键分析蛋白质纯度8、如果说某个基因是有前途的肿瘤治疗目标，那么抑制该基因的表达就可以治疗某种癌症。 最简单的方法就是，如果可以直接敲击这个基因的话就是【如果可以的话_】。 另一种方法是制备该蛋白质的抗体，中和抗体类型，直接与体内该蛋白质结合，抵消该蛋白质的功能。 从基因工程制药开始，结合抗体工程技术，制定技术上开发这种药物的战略计划，30分钟内可以解答吗？需要合理的依据。从杂交瘤细胞中提取总RNA用rtPCR获得重链可变区域基因片段/用/RNART-PCR获得轻链可变区域基因片段构建重链基因表达载体/构建轻链基因表达载体筛选阳性克隆转染细菌双重转染如何制备单克隆抗体及注意事项传统的细胞融合技术如何？ 转移到基因工程学时，会如何处理呢？淋巴细胞和骨髓瘤细胞经融合剂PEG处理，使两细胞融合，选择融合细胞制成单一细胞，培养杂交瘤细胞，克隆产生抗体的杂交瘤细胞，将克隆的杂交瘤细胞大量培养注入小鼠体内，小鼠腹水中含有单克隆抗体。注意事项：免疫动物应尽量提高与亲本骨髓瘤细胞同系的动物抗原免疫抗原的纯度，保证其活性、融合剂对细胞具有毒性，一般采用分析纯化规格。 浓度越高对细胞的毒性越大，防止操作污染。传统细胞融合技术：将适量的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过聚乙二醇的作用诱导融合，将时间控制在2min以内，用培养液慢慢稀释PEG融合液10、我们说单克隆抗体是前(金)景棒滴的魅力，我们又说单抗会被改造，为什么会被改造？能简单介绍几种改造的抗体形态吗？降低小鼠单克隆抗体分子的免疫原性，降低抗体的相对分子质量，提高组织通透性。人鼠嵌合抗体：人IgC-鼠IgV； 改变抗体人鼠CDR取代CDRFab的完全l链和FdFv VH和VL单链抗体VH-多肽-VL单区抗体VH或VL最小识别单位的CDR什么是固定化酶？固定化酶有什么优点？是指在一定的空间范围内发挥催化作用，可以反复连续使用的酶。优点：固定化酶可重复使用，提高酶的使用效率，降低使用成本。固定化酶易与反应体系分离，简化纯化工艺，产品产率高，质量好。多数情况下，酶固定化可提高稳定性。固定化酶的催化反应过程易于控制。固定化酶具有一定的机械强度，可通过搅拌和加入柱的方法作用于基质溶液，易于酶催化反应的连续化和自动化。固定化酶比游离酶更适合酶系统的使用，不仅利用酶系统的协同作用大大提高了酶催化反应速度，而且可以按一定顺序控制反应。我们谈谈酶工学制药好吗？酶工程制药：初步定义为利用酶的催化性质、动力学性质和可固定性质生产药物或药物中间体的技术体系。 是酶学理论与制药技术相结合的新技术根据其在制药过程中的应用，可分为具有治疗作用的药用酶和具有催化作用的酶，以及具有预处理作用的酶。酶工学制药的优点不需要有毒的原料反应条件温和提高原料中原子的利用率废弃物的排出少可以制作不能化学制造的药物。应用多方面：氨基酸生产、丙氨酸生产、抗生素生产我们简单谈谈动物细胞工程制药的优缺点好吗？缺点：培育条件高，成本高，产量低优点：操作简单，无化学毒性，对细胞损伤少，分泌细胞外，收集纯化比较方便，较完善的翻译后修饰与天然产品一致。14、生产用动物细胞的要求是什么？从正常组织液中分离出来的原代细胞，二倍体细胞系可以无限继代培养的转化细胞系，用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系我们说单位产量会影响公司的运营成本，以基因工程制药为例，谈谈如何在外来基因宿主细胞受体中实现高表达？有效的转录开始和基因的有效表达，选择与强调启动子相关的调节序列是构建有效表达载体的首要考虑问题。 最理想的强调启动子应该能够避免发酵初期表达载体的启动子受到严重阻碍，表达载体变得不稳定，细胞生长缓慢，或者产物表达导致细胞死亡等问题。 原核细胞有lac、trp、Pr、tac、phoA等诱导型启动子和T7噬菌体的启动子等构成型启动子。 在真核细胞的表达载体中，启动子和增强子作为两个重要的转录调控序列，是外源基因在真核细胞中高效表达所必需的。mRNA的有效延伸和转录终止及基因的有效表达。 转录开始后，mRNA开始有效延伸，终止和稳定积累，在此过程中转录物内衰减和非特异性终止会诱发转录中mRNA分子的早期终止。 衰减子序列是负调节元件，为了保证mRNA的转录安全，在构建表达载体时必须尽量避免其存在。 为了防止转录过程中mRNA的非特性终结，可将抗终结序列元素加入到表达载体中。 有效的翻译开始和基因表达，在原核细胞中影响翻译开始的因素有开始密码子、核糖体结合位点(SD )、开始密码子与SD的距离和核苷酸组成、mRNA的次级结构及其上游的5非翻译区序列和蛋白质编码区的5末端序列等。 作为翻译的开始，实现最大效率的一般原则是：1) AUG(ATG )是最优先的开始密码子。 GUG、UUG、AUU和AUA也可用作起始命令，但非优选2) SD阵列至少包括AGGAGG阵列中的四个碱基；3 )在SD和起始命令AUG之后的阵列为GCAU或AAAA阵列的情况下，可以提高翻译效率6 )通过改变mrna 5的非翻译区的核苷酸序列，减少或消除某些stem-loop结构可以提高翻译的启动效率。 mRNA的二级结构和基因的高效表达与真核和原核基因的表达无关，翻译的开始往往受mRNA不恰当的二级结构的影响。 二级结构较松散，无明显茎环