免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法

免疫沉淀实验操作方法(Immunoprecipitation)实验原理：免疫沉淀(IP)是利用抗原和抗体的特定结合以及蛋白A/G等细菌蛋白在免疫球蛋白(抗体)FC片段中特异性结合的现象，开发出的特异性分离和富集抗原的方法。agro se-proeina/g(agro se-proeina/g)与抗体结合，形成agro se-proeina/g、抗体、抗原复合物，并利用Agarose beads的重量用离心力富集实验阶段：1.细胞处理：根据实验目的设计实验，处理好细胞模型。一般3106细胞/处理(即6孔，约200ug总蛋白)。2.IP分解物：200ul/孔(6孔板)同时加入蛋白质酶抑制剂，如果蛋白质磷酸化水平影响实验结果，则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的当前活性。3.收集细胞：冰上操作，用分解细胞1PBS(4度)清洗1次，每个孔追加200ul IP分解物，冰上5分钟后刮取细胞，收集到EP管中。4.超声波：强度为37%，5秒4次(程序07)。目的是进一步分解细胞，干扰基因组DNA，但在影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时，要注意这一点。离心细胞分解液：4度10000rpm 10分钟。6.agro se-protenia/g清洗：典型的1ug抗体相当于15ul agro se-protenia/g(可能因公司产品而异，请注意结合手册和实验结果)，细胞分解物的agro se-proteneina/g使用相结合将相应的agro se-protenia/g导入EP管(切断枪管)，用500ul1PBS(4度)冲洗两次，然后用5000rpm 2分钟吸干清洗备用件。7.细胞分解物预清洗：如果细胞分解物没有特定效果，则用agro se-protenia/g进行预清洗。5级离心细胞分解物在6级清洗agro se-protenia/g中翻转1小时4度。8.抗体和agro se-protenia/g预孵化：预孵化抗体和agro se-protenia/g，以减少自由抗体消耗抗原的IP效率下降。将包含0.1%BSA的200 ul IP裂解液和相应的正抗体放入步骤6中清洗的agro se-protenia/g中，4度翻转1小时。根据抗体时间的不同，会有所不同。9.抗原抗体培养：步骤7，8后离心(5000rpm 2分钟)，将预洗细胞分解物转移到预培养抗体和具有agro se-protenia/g的EP管，4度孵化，过夜。10.IP复合物清洗：步骤9后离心(5000rpm 2分钟)，吸入，添加IP裂解液(通常不含抑制剂)500 ul，4度5分钟旋转后重复6次。最后离心后添加3SDS 60ul。11.WB测试。附注：Ip lysis缓冲区tris 50m ph 7.4Nacl : 150m埃塔2毫米Edta 1m3吨x-100 1%磷酸酶抑制剂：Pyrophosphate 2.5m MGlycerol phosphate 1m MNa3VO4 1m M蛋白酶抑制剂：PMSF 1m MLeupeptin 1ug/mlAprotinin 5ug/mlIp lysis缓冲区ReagentFinal concentrationQuantitytris-标准配备(fw 121.1)50毫米0.605gNaCl (FW 58.44)150毫米0.8766gEDTA(0.5M)1毫米0.2ml特里顿1%1mlHCl (FW 36.46)Adjust to pH7.4DdH2OMake up to 1