肌钙蛋白I的生化特点及其影响测定的因素VIP

肌钙蛋白I的生化特点及其影响测定的因素上海医科大学中山医院 潘柏申关键词肌钙蛋白（cTn）心肌损伤测定标准化随着研究和应用的发展，心肌肌钙蛋白（cTn）包括心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）已成为临床诊断心肌损伤的确定标志物1,2。由于仅一家生产厂商拥有cTnT生产专利，因此人们对cTnI的生产应用兴趣大增。目前FDA至少已批准8家生产厂商的共16种cTnI检测试剂3。在临床应用中发现，这些cTnI检测试剂的测定值之间存在着差异，不同的cTnI 分析方法对同一份标本的检测值最大可相差30余倍4，这使得各种方法的参考范围、分析干扰、分析变异、诊断窗口期以及诊断和预后的临界值等出现不同程度的差别，给临床应用和评价带来一定困扰。了解cTn特别是cTnI的系列化特别和各种分析测定试剂的特性，将有助于临床上正确使用这些方法检测和评价心肌缺血损伤。1 心肌肌钙蛋白细胞内结构和分布1.1心肌肌钙蛋白结构结构 cTn由三种亚基组成，参与调节肌肉收缩活动。其中的肌钙蛋白C（TnC）是Ca2+结合亚基，分子量18kDa，等电点4.1；cTnI为抑制亚基，分子量23kDa，等电点9.87；cTnT为原肌球蛋白结合亚基，分子量34kDa，等电点5.15。在Ca2+存在的情况下，TnC与Ca2+结合后构型发生变化，与cTnI的结合增强（Ka约为1.510-8M-1）5；TnT与TnC cTnI结合，但较TnC cTnI之间的结合弱。反之，Ca2+浓度低或TnC未与Ca2+结合时，TnC和cTnI之间的结合比较松散。cTnI-cTnT的结合相对较弱(Ka约为1.510-5M-1)5。1.2 心肌肌钙蛋白的组织含量 在心肌内cTnI的含量大约为5mg/g湿重组织，cTnT的含量大致为10.8mg/g湿重组织（相比之下，CK-MB仅1.4mg/g湿重组织6；cTn主要结合于心肌肌纤维中，少量（cTnI的2.8% 4.1%；cTnT的6% 8%）在细胞浆中以游离形式存在7。这与心肌细胞缺血损伤后的释放方式密切有关。1.3释放形式 心肌细胞损伤后，游离cTnT较早释放形成第一个峰，随后结合于肌纤维中的cTnT逐渐释放而出现第二个峰；由于细胞液中的含量较少，cTnI释放通常只有一个峰8。cTn一般在心肌损伤后5 8h外周血中出现增高，最高值在12 24h,增高可持续7 10天（cTnI）或10 14天（cTnT）8。1.4外周血中存在形式 外周血中的cTn究竟是以复合物还是游离形式存在，曾有过许多结果不同的研究报道。现在多认为，cTn释放主要是以TnCcTnIcTnT复合物形式，随后降解9。外周血中的cTnI既有游离形式，又有不同复合物的形式（cTnITnC、cTnIcTnT以及cTnTcTnITnC）10。在AMI病人中以cTnITnC复合物形式居多数（90%以上）410，cTnIcTnT复合物仅在不到50%病人的血中被发现，而且其中的cTnI仅占部cTnI的5%以下11，因此检测重要性远不如cTnITnC复合物；其他形式的cTnI较少10；cTnT游离形式较多见9。1.5抗体识别位点（抗原决定簇） 不同亚基复合物的形式使得一种抗cTnI的抗体不能识别另一结构形式cTnI的抗原决定簇。有的单克隆cTnI的抗体识别游离形式cTnI的能力较强；有些则主要以识别TnCcTnI复合物形式为主4。这使得采用不同抗体的各种试剂检测同一标本时出现检测结果不同的现象。2 心肌肌钙蛋白I的结构稳定性体外实验研究发展，AMI的心肌坏死组织培养3h后，cTnI的蛋白质一级结构、二级结构和三级结构都出现了程度不等的变化12。2.1 蛋白水解酶作用 研究发现，AMI后若血运未重新建立，心肌细胞在3060min内坏死，坏死细胞的溶酶体可释放多种蛋白水解酶。cTnI较不稳定，易受蛋白水解酶作用，在体外实验中发现迅速降解，但其不同部分受影响的程度有差别。cTnI的中心区域（第28位和第110位氨基酸）稳定生明显较高（可能是受TnC的保护作用）；氨基病和羧基端则对蛋白水解酶作用敏感12。氨基端水解后降解形成-14kDa的片段；羧基端则降解形成-18kDa的片段13。因此，欲提高检测敏感性和可重复性，抗体的识别位点最好位于cTnI的中心区域。2.2蛋白激酶A磷酸化 cTnI的第22位和第23位的丝氨酸易受蛋白激酶A作用发生磷酸化反应14，使cTnI形成四种形式：一种未磷酸化、两种单磷酸化和一种双磷酸化结构。研究发现，病人体内磷酸化形式的cTnI占相当数量。磷酸化可改变cTnI的分子结构形式和抗原性，从而影响某些抗体的识别15。2.3氧化还原形式 cTnI的第79位和第96位是半胱氨酸，容易发生氧化或还原反应。这种氧化或还原反应了可影响cTnI的分子结构形式和抗原性，从而影响某些抗体的识别能力。3 测定校准品各生产厂商的cTnI校准品内含的cTnI结构形式或含量各不相同，使得测定结果大相径庭。甚至使用同一份标定cTnI值的人血清进行校准也未能完全消除不同测定系统之间测定值的差异16。因此，有人提议最好采用从人心组织提取的cTnIcTnTCTnC复合物作为校准品12。4 抗凝剂为缩短检测周转时间（TAT），许多检测方法要求采用血浆或全血，以避免分离血清所需的时间。这需要合理选择适当的抗凝物。4.1 EDTA EDTA是Ca2+螯合剂，可促使cTnITnC复合物的解离，使游离型cTnI增加，从而影响测定值的真实性。因此，有些专家认为最好避免使用2。4.2 肝素 cTnI带有较多正电荷（pI 9.87）5,易于和带有负电荷的基团形成复合物。肝素带有负电荷，与cTnI结合形成的复合物可影响抗原一抗体反应，进而引起cTnI检测值降低。但在不同的cTnI检测试剂中，肝素的干扰程度不等17。为使cTnI的测定更加准确，