DNA损伤与修复和染色质维护.ppt

厦门大学研究生院课程： 分子细胞生物学，第一篇：基因表达调控与蛋白质修饰，第一章：真核基因表达调控第二章：表观遗传学第三章：非编码RNA与基因调控第四章： DNA损伤与修复与染色质维持第五章：翻译后水平的蛋白质修饰* (由我们课程安排) 第四章： DNA损伤和修复与染色质的组装和维持第一节DNA损伤的修复和其他响应系统第二节染色质的组装因子第三节RecQ螺旋酶和CAF-1与基因组的稳定性，细胞中的DNA含有完整的遗传信息，真核生物DNA与组蛋白的相互作用高度有序DNA和染色质在配子和合子形成后个体生长发育的细胞活动和基因表达过程中发生动态变化。 正常细胞具有一系列修复DNA损伤和染色质的维护系统，维持了基因组的稳定和DNA的完整性，确保了遗传信息准确地传到下一代和细胞功能的正常运行。 DNA损伤及其修复和染色质的组装和维持直接损害了基因组的稳定性。 如果基因组的稳定性受损，就会发生很多遗传、代谢性疾病和肿瘤。 因此，基因组稳定性调控和DNA修复机制的研究是生物医学科学的重要领域。 第一节DNA损伤的修复及其他应答系统，一是DNA损伤(DNAdamage )，DNA损伤是DNA分子物质的损伤。 活体细胞中的DNA总是受到损伤，估计每个人的细胞每天有1100万个分子伤害，但100万个分子伤害接近人类基因组的百万分之1.65 (估计含有人类二倍体基因组的60亿对碱基)。 但是，如果伤害发生在重要的基因(如抑癌基因)上，无法修复，细胞就会执行其能力，明显增加肿瘤形成的可能性和肿瘤异质性。因子、体内： DNA复制与染色质组装错误、自发损伤、代谢副产物如活性氧物质ROS、自由基等。 环境：物理因素如x、射线、紫外线、亚原子微粒等化学因素：直接致癌或间接致癌化学物质等生物因素：病毒、霉菌等多种因素可能对生物体内和体外环境造成DNA损伤。 (1)碱基缺失(baseloss)DNA上脱氧核糖与碱的糖苷键在生理条件下不太稳定，哺乳动物细胞每天有数千个嘌呤和数百个嘧啶的自然缺失，无嘌呤和嘧啶的部位(APsite，apurininc/apyrimidia ) 发生图5-1的碱基缺失、DNA损伤的类型是碱基缺失、修饰、包含错误的DNA链和分子的交联DNA单链、双链断裂等类型。 (2)碱修饰(basemodification)主要有3种，图5-2脱氨反应、(CH3 )、(5mC)(T )、(NH2 )、(CH3 )、(5- methyl-)、(thymidine )、(guanine )、(g )、脱氨基：核酸碱上的氨基也不稳定发生率：每1倍体基因组每天都会产生约100个尿嘧啶。 其他脱氨基反应包括腺嘌呤(a )和鸟嘌呤(g )向肌苷(I )的转化(hydrolysisfbases )，化学修饰：DNA可进行多种化学修饰。 在细胞氧化代谢过程中或细胞受到电离辐射作用时发生的图5-3的氧化修饰，除活性氧外，环境中的许多化学物质都是烷基化剂，可以在DNA中加入甲基或其他烷基，哺乳动物的二倍体基因组每天可产生数千个烷基化碱基。 (alkylation )、某些活性氧(纯态氧、过氧化氢自由基、过氧化氢、羟自由基)活性氧能够化学修饰碱，最常见的例子是胸腺乙二醇(图5-3)(oxidation )。 光损伤：细胞受到x线、紫外线照射后，其能量使丹发生化学反应，最常见的是产生新的化学键形成环丁基嘧啶二聚体(cycloobutanepyrinimidinedimers，CPDs )，其中T-TCPDs(图5-4 )、图5-4胸苷二聚体ThymineDimer、(3)复制错误(replicationerrors)DNA聚合酶非常准确，并且大部分复制过程中发生的错误可以迅速消除，但复制系统不完善，DNA复制过程仍然是碱基错误(4)链间交联(interstrandcrosslinks，ICLs )是指不同DNA链上的碱基之间的连接，主要是指一些双功能烷基化剂，如psoralens引起的UV照射和电离辐射在链间交联(5)DNA-蛋白交联(DNA-proteincrosss ) DNA拓扑异构酶在催化反应时与DNA形成共价键，通常该共价键瞬间可逆，但偶然该共价键不断地形成DNA与蛋白之间的稳定交联。 (6)DNA断裂(DNAstrandbreaks )正常细胞代谢过程中，拓扑异构酶、核酸酶、复制叉的崩解(collapse )和修复过程中可能发生丹的单链或双链断裂，但发生的概率特别低。 强电离辐射引起DNA的破坏。 二、DNA损伤的修复(DNArepair )，使用的生物高分子中只有DNA损伤的被修复，其他高分子损伤的被新分子取代。 细胞检测DNA损伤引起的双螺旋空间结构变化，根据损害DNA双螺旋结构的类型，可以采用不同机制修复损伤：1)如果可能，细胞以未改变的互补单链DNA或姐妹染色单体为模型，恢复原始信息。 2 )没有模板的情况下，细胞将某种“超越障碍合成”机制作为最后手段使用。 DNA修复机制根据修复方式的不同分为4种： (1)直接修复(directreversal)(2)切除修复(excisionrepair)(3)双链断裂修复(DNAdouble-strandbreakrepair)(4)损伤旁路(damage bypair ) MTHF和8-HDF光能的接受基受光，然后将能量利用FADH-，CPD光分解酶利用fadh上的能量将二聚体分解成单体(图55 )，图5-5CPD光修复示意图，(1)通过CPD光分解酶进行CPDs光修复(photoreactive ) 一种是所有光合降解酶的显色团共享的fad h2- (1，5 -二氢黄素腺嘌呤核苷酸)，另一种是MTHF (次甲基-四叶酸)或8-HDF(8-羟基-5-氮杂环丁烷)。 (300-500nm )，CPD光合酶广泛存在于细菌、真菌、植物和其他脊椎动物中，但胎盘哺乳动物中尚未发现。 (2)甲基鸟嘌呤通过甲基转移酶(MGMT )的修复是修复鸟嘌呤甲基化障碍的方式。 mgmt (methylguaninemethyltransferaseo6- methylguaninednamethyltransferase )通过将甲基鸟嘌呤的甲基转移至半胱氨酸来修复该烷基化障碍。demethyleationof6- o-methylguanosinetoguanosine，(O6mGG )、MGMT，因此修复牺牲了MGMT，烷基转移到该烷基转移酶后，永久失去活性。 MGMT介导的反应不是真正意义上的酶促(catalytic )反应，而是计量化学(stoichiometric )反应。 (3)某胞嘧啶和腺嘌呤甲基化伤害的逆转。 (以前研究过)、(2)切除修复(excisionrepair )、DNA单链损伤(Single-stranddamage )的修复方式。 即切除核酸酶损伤的碱基，以正常链为模板，通过DNA聚合酶在30 h末端延伸DNA连接酶连接间隙。碱基切除修复(BER-baseexcisionrepair )、氧化、烃化、水解或脱氨等单一损伤修复碱基； 修复核苷切除(NER-nucleotideexcisionrepair )，修复导致螺旋变化的核苷(包括CPDs )。 错配修复(MR-mismatchrepair )等。碱基切除修复(BER ) :一般为：(1)四个与特异葡萄糖苷酶(glycosylase )有关的酶催化损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基，在DNA中产生脱碱位点(AP site ) (2)脱嘌呤/脱嘧啶(AP ) 核酸内切酶在脱碱部位上游切出一个缺口，生成一个3- oh (3) DNA聚合酶延伸到3oh末端，DNA脂肪酶连接间隙。 在图5-6碱基切除修复的初期阶段，大多数苷酶只识别出一个损伤。 细胞有很多糖苷酶，但不能适应所有的DNA损伤。 核苷酸切除修复(NER):是一种更灵活的DNA修复机制，通过识别DNA上的异常结构和异常化学特性来识别DNA损伤，切除损伤的核苷酸。 核苷酸切除修复的过程更为复杂，涉及的蛋白质更多。 表5-2显示了在核苷酸切除修复中发挥重要功能的蛋白分子及其可能涉及的步骤。 其中有识别损伤部位的蛋白质，也有参与核苷酸切除的蛋白质。 这些蛋白质大多有相互作用，形成大的复合体。 核苷酸切除修复过程：首先从多聚体复合体中识别损伤，在损伤两侧切除。 随着DNA链的解开，包含损伤的单链片段被释放出来，残留的间隙被DNA聚合酶填埋，DNA连接酶被关闭。 该途径含有20多种蛋白质，可修复紫外辐射诱导的环丁嘧啶二聚体(CPD )和一些化学物质产生的大附加物。 NER还可以分为两个子路由(1)全基因组修复(globalgenomicrepair，GGR )路由：修复全基因组中的损伤，其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。 (2)转录耦合修复(trancsription-coupledrepair，TCR )途径：特异性修复基因组中转录活性基因在转录DNA链上的损伤，该途径的特征通常依赖于RNA聚合酶催化的转录，其中错配修复(mismatchrepair，MMR ) :主要负责修复DNA复制过程中发生的错配碱基。 它检查新生DNA链的碱基序列是否错误，通过将其切除，用正确的序列填补间隙。 错配修复基因的识别首先来源于E.coli的研究。 在E.coli中担负着错配修复的主要任务的是MutS(MutatorS )，MutL和MutH，它们以同源二聚体的形式与DNA结合起来发挥作用。 MutS识别并结合新生链上的错配碱基，然后MutL也与该DNA蛋白的复合体结合，对它们的结合起着稳定的作用。 MutS-L复合体向GATCm部位移位，激活结合的MutH (核酸内切酶)，在亚链未甲基化的-GATCm序列接近鸟嘌呤的5端处形成切口，切除了含有错配碱基的数百个碱基。 之后，DNA聚合酶与DNA连接酶的合作，以正确的链为模板合成正确的新生链。 但是，利用DNA序列甲基化来区分母链和新生DNA链的可能只有E.coli。 图5-7原核细胞的错配修复，x、(包括切除的错配片段)真核细胞中存在多个MutS和MutL同源物，其中人细胞中存在5种MutS同源物hMSH2-6和3种MutL同源物hMLH1、hPMS2和hPMS1，蛋白从序列到蛋白功能相似MutS的同源物质也识别错配碱基并结合，然后MutL的同源蛋白与该复合体结合。 与原核细胞不同，真核细胞MutS和MutL的同源蛋白作为异源二聚体发挥作用。 人细胞中的MutS异源二聚体主要有MutS(MSH2-MSH6 )、MutS两种。 MutS主要识别单一碱基的错配和小碱基插入或缺失形成的环(12碱基)，MutS识别大环(210碱基)。 真核细胞中的MutL异源二聚体主要由3种(包括mlh1):mutl、PMSl (酵母)或PMS2(人)和细胞中MLH1的90%组成； MutL由MLH1和MLH2(酵母)或PMS1(人)组成； MutL包括MLH1和MSH3。图5-9真核细胞错配修复、MutS-MutL二聚体识别并结合错配碱基，联合RFC、PCNA等修复蛋白参与真核细胞DNA错配修复。*RFC=ReplicationfactorC，aproteincomplex .* PCNA=profilifyritingcellnuclearantigen，aDNAclamp， diagramofdnammrpathways eukaryotes profreading (nicks present ) (b ) mostbacteriasimilarto (a ) (c ) e.colihemimethylation (gram-negative )，以及science 23 December 20113360 vol.334 no.6063 PP.1713-1716 doi :10.1126/science.1210770、(三)双链断开修复(DNAdouble-strandbreakrepair )、双链DNA 这两条途径均涉及多个修复蛋白，经多步反应修复受损DNA。 (1)同源重组修复(homologousrecombinationalrepair，HRR )通过同源重组方式，从姐妹链或同源染色体获得正确的遗传信息，正确修复被切断的DNA。 (图5-10 )首先细胞中核酸外切酶如MRE11/Rad5