葡聚糖凝胶G-25的使用方法

使用葡聚糖凝胶柱的方法：(1)预处理称取约5g sephadex g-25(50-100目)，加入100毫升蒸馏水，室温下溶胀3小时。(2)柱荷载凝胶色谱柱直径与色谱柱长度之比通常为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡胶塞塞住，底部用水洗玻璃纤维(约200目尼龙布)填充，或者购买类似规格的商品柱。然后垂直安装柱，先加入1/3柱体积蒸馏水，然后边搅拌边不断填充溶胀的凝胶，使凝胶自然沉降在柱内。同时，下部开口较宽，蒸馏水缓慢流出。装载色谱柱后的凝胶必须均匀，没有气泡或明显的条纹。否则，必须重新装载，在包装样品并用蒸馏水平衡2-3小时后，可以添加样品进行分离。(3)样品添加在添加样品之前，首先放出柱中凝胶上的过量蒸馏水，直到柱中的液位与凝胶表面齐平(或留下非常薄的液体层)。然后，从柱的上端加入2ml水解液，小心不要让溶液将凝胶洗松并漂浮。加入样品后，打开下端口缓慢释放液体，直到液面与凝胶表面齐平，然后用少量蒸馏水冲洗装有样品的容器2-3次，待所有样品进入色谱柱后洗脱。(4)洗脱和收集洗脱时，用蒸馏水作为洗脱液，应连续进行，以保持凝胶柱上端有一定的液体层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验中洗脱液的洗脱速度应控制在0.8-1.0毫升/分钟。以连续顺序收集洗脱液，每管3毫升，共10管。根据经验，管4或5具有最高的核苷酸浓度，可用作色谱鉴定的样品液体。然而，由于色谱柱长度的不同，管数会发生变化。如有必要，最高浓度的试管数可通过在260纳米的紫外检测找到。(5)凝胶再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲洗并松开一次，平衡后再使用。如果多次使用，需要进行再生处理。浸泡在0.1摩尔/升氢氧化钠-0.5摩尔/升氯化钠溶液中，然后用蒸馏水洗涤至中性，备用。如果实验完成，将再生的凝胶洗涤并用布氏漏斗上的蒸馏水排出，用95%乙醇洗涤两次，在60烘箱中干燥，并循环保存。实验5。葡聚糖凝胶色谱法实验目的1.掌握葡聚糖凝胶的特性和凝胶色谱的原理。2.学习葡聚糖凝胶色谱的基本操作技术。实验原理凝胶色谱，也称为分子排阻色谱或凝胶过滤，是一种基于分离物质分子量差异的色谱分离技术。这项技术为纯化生物大分子如蛋白质提供了一种非常温和的分离方法。色谱固定相载体是目前广泛使用的凝胶颗粒：不同孔径的葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。葡聚糖凝胶是由直链葡聚糖分子和交联剂3-氯-1，2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网络结构的高分子化合物。通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒中的网眼尺寸。交联度越大，网状结构越紧密。交联度越小，网孔结构越松散，网孔的大小决定了分离物质可以自由进入和离开凝胶的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万。葡聚糖凝胶层析是将待分离的物质通过葡聚糖凝胶层析柱，由于不同的分子量和对凝胶柱的不同阻断作用，各成分在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶完全阻断，不能进入凝胶颗粒，阻断效果小。当溶剂在凝胶颗粒之间流动时，过程很短，首先从色谱柱流出。小分子量的物质可以完全溶解本实验以葡聚糖凝胶G-25为固定相载体，分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖-2000的分子量接近2106，而溴酚蓝的分子量为670。蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝的分子量差别很大。前者可以完全排除，而后者可以完全进入凝胶颗粒的网孔。两者通过色谱柱的不同时间进行分离。实验材料1.实验设备色谱柱(120厘米)附有一小段乳胶管和螺旋夹。洗提瓶(下口三角瓶，250 m1)；试管和试管架；测量缸10m1；721分光光度计2.实验试剂(1)Tris-乙酸缓冲液(pH7.0):取900毫升0.0摩尔/升Tris溶液(包括0.1摩尔/升KCl)，用浓乙酸调至pH7.0，加蒸馏水至1000毫升。(2)溴酚蓝溶液：称取10 mg溴酚蓝，溶于5 ml乙醇中，充分搅拌溶解，然后逐滴加入Tris-乙酸缓冲液(pH7.0)，直至溶液呈深蓝色。(3)蓝色葡聚糖-2000溶液：称取蓝色葡聚糖-2000 10 mg，溶于2ml Tris-乙酸缓冲液(pH7.0)中。(4)样品溶液：将0.1毫升溴酚蓝溶液和0.5毫升蓝色葡聚糖-2000溶液混合均匀，得到上柱样品溶液。(5)葡聚糖凝胶G-25实验操作1.实验凝胶的制备：市售凝胶为干燥颗粒，使用时需要溶胀处理。称取4克葡聚糖凝胶G-25，加入50毫升蒸馏水，搅拌均匀，室温下溶胀6小时，或在沸水浴中溶胀2小时，一般采用后一种方法。通过倾倒法除去上层水和凝胶的微粒，用蒸馏水洗涤几次，用缓冲溶液(pH7.0的Tris乙酸溶液)洗涤2-3次，以平衡酸碱度和离子强度，最后除去溶液中的气泡和凝胶微粒，凝胶可以储存在缓冲溶液中。2.装柱：清洗色谱柱，将其垂直固定在铁支架上，选择薄膜端作为色谱柱的下端口，将下端口连接到乳胶管上，用螺旋夹将其夹住。向色谱柱中加入洗脱液，打开下方开口处的螺旋夹，让溶液流出，消除残留气泡，最后保留高度约2厘米的洗脱液，并拧紧螺旋夹。轻轻均匀搅拌凝胶，用玻璃棒沿色谱柱内壁慢慢将凝胶注入色谱柱。当凝胶在柱床下沉积超过1cm时，打开下部开口处的螺旋夹，继续装载柱，直到柱床高度达到8 cm，并关闭出口。柱加载过程中严禁出现气泡，应尽快加载以避免分层。然后用洗脱液平衡L至2个柱床的体积，一定量的洗脱液始终保留在凝胶表面。平衡后，拧紧下部螺钉夹。3.添加样品：打开螺旋夹，使圆柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面齐平，关闭下端出口。取0.3毫升溴酚蓝和蓝色葡聚糖-2000混合溶液，小心地涂在凝胶表面。请勿搅动色谱柱床面。打开下部出口，让样品溶液进入凝胶并开始收集流出物。当样品溶液刚好与凝胶表面齐平流动时，关闭下部出口。用少量洗脱液清洗色谱柱的加样区，并清洗三次。每次洗涤液完全进入凝胶柱后，再次洗涤。最后，将洗脱液加入凝胶表面，使高度保持在3-4厘米。4.洗脱和收集：连接凝胶柱色谱系统，调节洗脱液流速至每分钟1毫升进行洗脱。仔细观察样品在色谱柱中的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升更换一个收集管(试管预先编号)，收集约20管，样品可以完全洗脱。用721分光光度计在540纳米波长下测量每个收集管中的洗脱液。5.凝胶回收处理方法：样品完全洗脱后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶，将柱的下口放在小烧杯中，慢慢打开，然后慢慢松开上口，将所有凝胶回收到小烧杯中备用。印刷葡聚糖凝胶LH20的分离原理主要包括两个方面：凝胶过滤和反相分布(在反相溶剂中)。由于凝胶过滤，大分子化合物保持弱，首先洗脱，小分子化合物保持强，最后离开色谱柱。如果使用反相溶剂进行洗脱，Sephadex LH20也在化合物的反相分布中起作用，因此大极性的化合物保持较弱并首先洗脱，而小极性的化合物保持较强并随后离开色谱柱。如果使用正相溶剂进行洗脱，则主要通过凝胶过滤进行分离。3 Sephadex LH20洗脱溶剂。在阅读点2后，应该清楚的是，Sephadex LH20洗脱溶剂可分为两种类型：反相和正相。反相溶剂最常用于洗脱，甲醇-水系统最常用。首先，用水，甲醇的比例逐渐增加，最后，用100%甲醇冲洗色谱柱。氯仿-甲醇是最常见的正相体系。首先，用50%的氯仿-甲醇逐步增加甲醇的比例。最后，用100%甲醇冲洗色谱柱。4 sephadex lh20样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，用反相溶剂(甲醇-水)洗脱，样品用最少量的甲醇-水溶解(尽可能少用甲醇)。过滤后，用湿法装载样品(一定要过滤！如果Sephadex LH20被阻断，Sephadex LH20的柱头部分将不得不被丢弃，这是非常痛苦的。如果样品的极性很小，用正相溶剂(氯仿-甲醇)洗脱，用最少量的氯仿-甲醇溶解样品，过滤并湿装。5 Sephadex LH-20步骤。(1)选择标准：在使用葡聚糖凝胶时，梯度洗脱不如正相柱色谱重要。首先，您的样品必须能够溶解在尽可能少的洗脱液中。存在极性的甲醇-水系统；对于极性小的，一般使用无水系统。正己烷二氯甲烷甲醇系统是我们实验室常用的系统，已使用多年，效果良好。(2)饱和色谱柱：用洗脱液充分摇动凝胶，拉直柱体，使其自然沉降。这时，应该防止气泡留在里面。打开开关至少半小时，流出几个柱类型的洗脱液，使其以正确的洗脱液比例膨胀。(3)样品处理：用尽可能少的洗脱液溶解样品，在常压下过滤。(4)湿柱加载。这也是一个巧妙的步骤。(5)洗脱：控制流速，一般在1drop/s以下，见厂家的一些参数；如有必要，改变极性(在许多情况下，一种极性可以完全洗脱样品)。再生供下次使用。6分离技巧，最后告诉我关于我的经历(1)流速不能太快，也不能太快。所谓欲速则不达。(2)该列应尽可能长。葡聚糖凝胶LH20柱长的增加将大大提高分离效果。不要吝惜包装。相反，填料应该装在一个大的柱子上，而不是几个小的柱子上。所谓集中优势兵力攻击敌人。(3)分数必须是精细的，并且可以通过1/10或1/20的保留体积连接成一个分数。(4)洗脱体积通常为2-3个保留体积。对于具有强特殊保留的化合物，可以洗脱5个保留体积。(5)单宁吸附不良。如果你不在乎填料，Sephadex LH20可以用于单宁。(6)葡聚糖凝胶LH20对黄酮类化合物有很好的分离效果。这种方法形式很好，有大量的参考文献。(7)反复使用填充剂，当填充剂用完时，可以用甲醇将柱清洗干净，然后用下次分离的起始溶剂替换甲醇以备后用。葡聚糖凝胶LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化制备的分子筛凝胶，特别适用于有机溶剂中天然产物的纯化。例如类固醇、萜类、脂类和小分子多肽等。Pharmadex LH-20适用于分离具有非常相似的分子类别和工业规模制备的物质，可用于初步纯化步骤和最终纯化步骤，如分离非对映体。1.立柱安装装填的重要原则之一是形成稳定和均匀的柱床。胶体颗粒越均匀(颗粒尺寸分布越窄)，就越容易获得稳定和均匀的柱床。然而，对于Sephadex LH-20，25 100微米的粒度范围是不均匀的，即与许多用于制备色谱的填料相比，其粒度分布更宽。然而，当凝胶膨胀时，相对容易获得均匀的柱床。对于长柱(最长250厘米)也是如此。在装载色谱柱之前，色谱柱和储罐必须彻底清洁。葡聚糖凝胶LH-20在使用前必须溶胀。溶胀过程中，应尽可能避免过度搅拌，否则会破坏球形胶体颗粒，应避免使用磁力搅拌器。室温下，凝胶在色谱溶剂中溶胀至少3小时。溶胀凝胶体积的大小取决于所用的溶剂系统。请参考背面的干凝胶膨胀表，计算特定色谱柱体积所需的干凝胶量。溶胀凝胶体积沉淀后，占总体积的75%，上层溶剂占25%。此时，当悬浮液从一个容器倒入另一个容器时，胶体颗粒会移动。根据装柱要求，将溶胀凝胶均匀倒入柱中。在确保胶体颗粒不变形的前提下，色谱柱应在尽可能高的压力下加载，背压不得超过1.5巴。2.平衡加载前，使用洗脱液平衡色谱柱的至少两个柱的体积，直到基线变