PCR引物设计及Primer_Premier_50使用介绍.ppt

PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,PCR介绍引物设计原理引物设计的优化原则PrimerPremier5.0介绍举例说明引物的设计,PCR介绍,1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率（定量，对照）,引物设计原理,引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。,引物设计的原则,1、引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的(1618)的引物；若产物长5kb，则用24个核苷酸的引物。有人用2023个核苷酸引物得到40kb的产物。,引物设计的原则,2、引物GC含量GC含量在40%60%之间，以45-55为宜。这可为有效退火提供足够热。,引物设计的原则,3、引物Tm引物所对应模板序列的Tm值最好72左右。至少要在5580之间。Tm=2(A+T)+4(C+G),引物设计的原则,4、引物3端引物3末端和模板的碱基完全配对防止一对引物内的同源性考虑末端5个碱基的G引物3端要避开密码子的第3位,引物设计的原则,5、引物序列与模板序列组成的相似性可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。,引物设计的原则,6、最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。,引物设计的原则,7、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。,引物设计的原则,8、碱基要随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。,引物设计的原则,9、引物应具有特异性引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。,引物设计的原则,10、G值G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。,引物设计的原则,11、引物的5端引物的5端可以修饰，而3端不可修饰，引物5端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。,引物设计的原则,12、在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定(如GC含量较多)，而3末端不太稳定(如AT含量较多)的引物,PrimerPremier5.0简介,主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析,PrimerPremier5.0使用介绍,PreimerPremier启动界面,Loadsequence,基本信息,Sequencename,Originalsequence,UsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好,Chooseafunction,引物设计界面,Firstyoucandesigntheprimermanually,Sensestrandoranti-sensestrand,Usefulinformationoftheprimer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But,引物编辑,引物编辑,Editprimerhere,Analysistheeditresult,AccepttheeditresultReturntothemainwindow,任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1,举例说明,SP,BamHI,pcDNA3.1,NR1,Plasmid1:,Plasmid2,GFP,SP,BamHI(GGATCC),pcDNA3.1,NR1-1a,GFP,121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa,NR1的编码序列(4000bp),红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框,ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA,GFP序列(700bp),引物要求,PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变,5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA33TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5,GFP序列,5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3,3TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC,.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5Primer2,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2:5TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,第一步：扩增GFP基本序列,变性,引物复性,第二步：GC比值；Tm值,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）,第三步：酶切位点,Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）,BamHI:ggatcc,Primer1:5ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第四步：阅读框,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct.,Primer1:5ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,NR1序列：,Primer1:5ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct,NR1序列：,5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3,GFP序列,cgcgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG?ggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgac