LC-MS知识介绍

1、如何看质谱图(1)确定分子离子，即确定分子量：氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在38和1013，2125之间均不可能，则说明是碎片或杂质。(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式： 高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式，低分辨质谱利用元素的同位素丰度。M-1，M-15，M-18，M-20，M-31.意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3.(3)峰强度与结构的关系，丰度大反映离子结构稳定：在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键的电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断。2、离子源EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离硬电离。CI(Chemical Ionization):化学电离核心是质子转移。FD(Field Desorption):场解吸目前基本被FAB取代。FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱)。 ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离是最软的电离方式，采用离子蒸发，通常小分子得到M+H+,M+Na+或M-H-单电荷离子；化合物无需具有挥发性，离子在溶液中已生成；样品流速0.2-1mLmin；适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)，生物大分子产生多电荷离子，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization): 大气压化学电离也是软电离技术，高压放电发生了质子转移而生成MH+或M-H-离子；化合物要具有挥发性且热稳定，离子在气态条件中生成；样品流速0.2-2mLmin；只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):更适宜做非极性分子。其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)。MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离，通常用于飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子。NanoSpray离子源：适合于做微量的生化样品，其流速范围可从5nLmin-1uLmin。一滴样品就可做数小时的分析，可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度（高达Fmole），并可直接与微孔HPLC联用。3、质量分析器：双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector)、四极质谱仪(Q)、飞行时间质谱仪(TOF)、离子阱质谱仪（TRAP）、傅利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS)、三重四极（QqQ）、四极+TOF（Q-TOF）。离子源第一分析器MS1碰撞室第二分析器MS2接收器碰撞诱导解离(collision-induceddissociation，CID)质谱：选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(碰撞气体：N2、He、Ar、Xe、CH4等)，发生离子-分子碰撞反应，从而产生子离子，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID谱。4、正、负离子模式的选择： 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。5、流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LCMS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须1mmol/ L。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5mmol/L。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。6、流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1-50uLmin，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用1-2.1mm内径的微柱，TIS源最高允许1mLmin，建议使用200-400uLmin，APCI的最佳流速1mLmin，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用100mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。7、辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。8、样品的预处理常用方法超滤；溶剂萃取去盐；固相萃取；灌注（Perfusion）净化去盐；色谱分离（反相色谱分离、亲和技术分离）；甲醇或乙腈沉淀蛋白（尽量高转速12000rpm以上，低温离心2次）；酸水解和酶解；衍生化9、化合物鉴别全扫描方式（Q1扫描）：可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。选择离子监测（SIM）：用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子。母离子扫描：母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。子离子分析（MS/MS）：用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。中性丢失扫描：中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失18Da的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。10、用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息-Na 22Da. Higher than M+H -K 38Da. Higher than M+H-Li 6Da. Higher than M+H-NH4 17Da. Higher than M+H-CAN 40Da. Higher than M+H2M+H,2M+Na等-TFA 114Da. Higher than M-H(113 and 227 background)-Acetate 60Da. Higher than M-H-Formic 46Da. Higher than M-H-Cl 36Da. Higher than M-H11、LC-MS中常见的本底离子m/z 50-150，溶剂离子，(H2O)nH+，n=3-112m/z102，H+乙腈+乙酸，C4H7NO2H+，102.0549 m/z149，管路中邻苯二甲酸酯的酸酐，C8H4O3H+，149.0233m/z288，2mm离心管的产生的特征离子 m/z279，管路中邻苯二甲酸二丁酯C16H22O4H+，279.1591m/z316，2mm离心管的产生的特征离子m/z384，瓶的光稳定剂产生的离子m/z391，管路中邻苯二甲酸二辛酯，C24H38O4H+，391.2843m/z413，邻苯二甲酸二辛酯+钠，C24H38O4Na+，413.2668m/z538，乙酸+氧+铁（喷雾管），Fe3O(O2CCH3)6,537.879312、影响分子量测定的因素 1）pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形。 2）气流和温度：当水含量高及流量大时要相应增加。 3）溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。 4）溶剂和缓冲液的类型：通常正离子用甲醇好，负离子乙腈好些5）选择合适的液相色谱类型：正相、反相、选择合适的色谱柱 6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时回使多电荷离子比例低，多聚体也减少7）样品结构和性质 8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好。去污剂、表面活性剂会有离子抑制现象发生， 表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据，因此不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等容器，如果一定要用，建议超声清洗多次。如果遇到离子抑制，可以试试把你的样品峰往后推推或者改变提取方法，也可以试试用APCI源。9）样品浓度不够，有时需要浓缩；但也不能太高，12ug/mL即可，否则容易残留。13、注意事项样品必须过0.22um滤膜过滤；反相体系不允许用正己烷之类极性弱的溶剂溶解样品并上