第八章培养基灭菌概要.ppt

,第八章培养基灭菌,在深层、通风的发酵罐中进行绝对无杂菌的纯培养发酵，是生化工程所特有的问题。从防止污染的工艺观点看，生化工程工作者所作出的最重要的贡献可能就是在发酵罐及与之有关的管道网的设计与操作中推行和发展了无菌技术。本章首先概述培养基灭菌的意义与方法，然后对培养基湿热灭菌的原理及工程计算加以阐述。重点：掌握培养基蒸汽加热灭菌的原理与计算，了解空气过滤除菌的机制和过滤器的设计计算。,第一节概述,微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技术以来，许多发酵过程特别是抗生素、氨基酸等新型发酵工业都要求纯种培养，即在培养期间除大量繁殖生产菌外，不允许其它任何微生物(统称为杂菌)存在。在培养过程中(特别是种子扩大培养阶段和发酵前期)如有少数杂菌存在，它们便可在极短时间内迅速繁殖与生产菌争夺养分，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒罐。,为了保证发酵过程不感染杂菌，除要求设备密封及严格无菌操作外，灭菌和消毒就成为生产或实验成败的关键问题。在工作中所用的仪器、培养基、发酵罐、管路、空气等必须进行严格的灭菌，还要对生产环境进行消毒，以保证生产菌旺盛生长，防止杂菌和噬菌体的污染。所谓灭菌(Sterilization)指的是用物理或化学因子除去物品上所有生活微生物的方法，而只消除病原微生物的措施则是消毒，一般都笼统地称为杀菌或灭菌。培养基及设备灭菌的方法有许多种，如加热灭菌、射线灭菌和化学药剂灭菌等。,1、加热灭菌微生物细胞由蛋白质组成，加热可导致蛋白质变性，从而达到消灭微生物的目的。微生物对高温的敏感性大于对低温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。(1)火焰灭菌：利用火焰直接将微生物烧死，是一种比较彻底、迅速而简单的加热灭菌法。但它只限于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶口及接种管口等的灭菌，只是在接种时使用。,(2)干热灭菌：利用电热或红外线在一定设备内加热到一定温度把微生物杀死，一般用于不宜直接用火焰灭菌、要求杀菌后保持干燥状态的物料的灭菌。干热灭菌必须采用高温，常在160170维持12h。(3)湿热灭菌：按被灭菌物品的性质不同，选择各种不同温度的蒸汽进行灭菌。由于细胞原生质在含水量高的情况下易变性凝固，而且蒸汽的穿透力强，所以在同样温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果要好，加之蒸汽来源容易，因而此法在工业生产上广泛使用。,2、射线灭菌通常使用紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和射线等，以紫外线最常用。紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对其抵抗力较大，且紫外线穿透力极低，所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。一般无菌室、无菌箱和摇瓶间等可采用30W紫外线灯照射2030min，以波长260nm左右灭菌效力最好。3、化学药剂灭菌消毒剂或防腐剂的种类很多，常用的有以下几种：(1)0.10.25%KMnO4溶液：用于皮肤、水果、饮具的消毒。(2)0.51%漂白粉溶液：用于用具和车间环境灭菌。(3)75%酒精溶液：用于皮肤和玻璃器皿表面灭菌。,(4)0.25%新洁尔溶液：用于皮肤和小器皿表面消毒及环境消毒。(5)10%甲醛溶液：用于无菌室、摇瓶间、空罐和车间的熏蒸消毒，一般每m3空间使用3740%甲醛10mL。(6)苯酚溶液：25%的苯酚(石碳酸)溶液用于器械及车间环境的喷雾消毒，0.5%的溶液为防腐剂。(7)来苏尔：是甲醛与肥皂的混合液，常用25%的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等，对皮肤刺激性比石碳酸小。,谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（）A高压蒸汽灭菌B高温灭菌C加入抗生素灭菌D酒精灭菌,消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）的区别？,消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。,培养基的湿热灭菌,将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。,（一）间歇灭菌（常用）,培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况,过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。,蒸汽,（二）连续灭菌（又称连消）,将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。,连续灭菌的流程与设备,（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌(126132）；,（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4）冷却管，使料液冷却到4050后（冷水喷淋），输送到预先灭菌过的罐内。,连续灭菌过程中温度的变化(虚线),（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较,第二节加热灭菌的基本原理,灭菌的方法虽然很多，但对发酵工业中大量培养基和生产设备的处理，目前广泛采用蒸汽加热的方法进行灭菌。实际生产上，蒸汽较易获得，蒸汽温度高，冷凝时能放出大量的潜热，加速嗜热菌芽孢的死亡，操作控制也较方便，因而湿热蒸汽灭菌是一种简单而又经济有效的灭菌方法。用湿热法处理培养基时，在微生物被杀死的同时，培养基成分也受到一定的破坏。对于灭菌的要求是既要达到杀菌的目的，又要使培养基成分破坏尽可能减少到最低程度。因此，灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。,一、微生物的热阻每一种微生物都有一定的生长温度范围。当微生物处在最低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。相反，温度超过最高限度时，细胞中的原生质胶体和酶蛋白就发生不可逆的凝固变性，使微生物在一定时间内死亡。加热灭菌就是根据微生物的这个特点进行的。杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力，常用“热阻”表示。热阻是指微生物在某一特定条件下的致死时间。,二、微生物的热死原理对数残留定律在一定温度下，微生物的受热死亡符合单分子反应动力学。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残存活菌数的减少而递减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌数成正比，这就是对数残留定律：-dN/dt=KN式中：N残存活菌数；t灭菌时间(min)；K杀菌速率常数(min-1)，也称为反应速度常数，其大小与微生物的种类和加热温度有关；dN/dt菌的瞬时变化率，即死亡速率。,将存活率与灭菌时间t在半对数坐标纸上标绘可以得到直线。,直线的斜率为K，K值越大表示微生物越容易死亡。,ln,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热死速率,K值越大表示微生物越容易死亡。,ln,K（比热死亡速率常数）由两个因素决定1、微生物的种类和存在方式2、灭菌温度在一定温度下，比热死亡速率常数K随微生物种类不同而不同。例如，在121，枯草芽胞杆菌FS5230的K：0.0470.063s-1；梭状芽胞杆菌PA3679的K：0.03s-1；嗜热脂肪杆菌FS1518的K：0.013s-1。,在恒定温度下，将方程移项积分：N0开始灭菌(t=0)时原有活菌数(污染度)；Ns经时间t后残存活菌数(灭菌度，一般要求Ns=10-3)；反应速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样温度下的K值不同，并受菌的生理状态、生长条件及杀菌方法等多种因素的影响。K值愈小，则此微生物愈耐热。有时习惯上也有采用1/10衰减时间D(decimalreactiontime)来表示的，D值是活的微生物在受热过程中减少到原来数目的1/10(N/N0=1/10)所需要的时间。D与K成反比关系：,就各种微生物的热阻来说，细菌芽孢是较耐热的，孢子的热阻要比生长期细胞大得多，即细菌芽孢的K值比生长期细胞和霉菌孢子小得多。故灭菌程度要以杀死细菌的芽孢为准。但对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留定律，特别是在受热后很短的时间内。,三、温度对杀菌速率常数K的影响微生物受热蛋白质变性而死亡，这种反应属于单分子反应型，所以温度对杀菌速率常数的影响可以用阿累尼乌斯(Arrhenius)方程表示：K=Ae-E/RT或lnK=lnA-E/R1/TK杀菌速率常数(min-1)；A频率因子(min-1)，因菌种不同而异；E活化能(J/mol)，其值愈大，微生物越易受热死亡；T绝对温度(K)，T(K)=t()+273.15；R气体常数，等于8.36J/molK(或1.98cal/molK)；,四、影响培养基灭菌的因素1、营养成分的保持在培养液加热杀菌时，不仅杀死杂菌，培养基成分也受热变化，尤其是维生素、氨基酸、葡萄糖等营养成分也会受热破坏。所以在灭菌过程中，既要达到灭菌效果，又要考虑尽量减少营养成分的破坏。培养基成分受热分解的反应也是属于一级反应，符合对数残留定律和阿氏方程：-dC/dt=KCK=Ae-E/RT式中：K营养物破坏的反应速度常数(min-1)；C营养物浓度(mol/L)；E营养物分解反应的活化能(J/mol),在活化能大的反应中，反应速率随温度变化也大；反之，如果某一反应的活化能非常小，那么该反应的速度随温度的变化也很小。所以当温度升高时，杂菌死亡速度要比营养成分破坏速度快得多。根据这一道理，培养基灭菌采用高温短时的方法，可以减少营养成分的破坏。养分虽因温度增高破坏也增加，但因灭菌时间大为缩短，总破坏量因之减少。,2、微生物的耐热性无芽孢的细菌在60加热60min或70加热5min即可杀死，霉菌孢子在8688加热3min也可杀死。但是有些细菌芽孢的热阻较大，100处理30min仍未杀死。培养基中含有各种各样的微生物，不可能逐一地加以考虑。在灭菌计算中，如将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来计算灭菌温度和时间，这样就势必加长加热时间和提高加热温度。灭菌所需要的时间取决于把活的细菌芽孢减少到所规定数目的时间。同时，由于一个细菌只能形成一个芽孢，故把培养基中原有芽孢细菌和细菌芽孢数之和作为计算依据较为合理。,3、pH值pH值对微生物的耐热性影响很大，pH=6.08.0时，微生物最不易死亡，pH6.0时，H+很易渗入微生物的细胞，从而改变细胞的生理反应，促使其死亡。所以，培养基的pH值愈低，所需的灭菌时间也愈短。但一般情况下，微生物对培养基的pH值都有一定的要求，在不允许调节pH值的情况下，就要适当考虑延长维持时间或提高灭菌温度。,4、培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加生物的耐热性。高浓度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜影响热的传入，所以灭菌温度应较高。而高浓度的盐类(810%以上)、色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。例如，大肠杆菌在水中加热至6065便死亡，在10%糖液中需70加热46min才死亡，在30%糖液中需要30min才死亡。5、泡沫培养基中发生的泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中潜伏的微生物。在分批灭菌中，对极易起泡的培养基必须予以很好的控制。若产生泡沫要采取措施加以破坏，如可加入少量消泡剂。对极易产生泡沫的培养基，如采用连续灭菌的方法更应注意。,6、颗粒培养基中含的颗粒小，容易灭菌，颗粒大时，则难灭菌，对于含有1mm颗粒的培养基，一般采用根据计算所定的灭菌温度和时间，而不必提高；对于含有少量较大颗粒及粗纤维的培养基，可用粗滤方法(不应影响培养基质量)予以除去。培养基结块会造成灭菌的不彻底，必须注意。,第三节分批灭菌的计算,一、基础条件的确定1、污染度N0:灭菌开始时，污染的培养基中的杂菌个数(个/mL)，也称为原始污染度。前已指出，不能对培养基中的各种微生物逐一考虑，N0应取原有芽孢细菌数和细菌芽孢数之和。一般假定N0为104106个/mL。2、灭菌度Ns：经过灭菌时间t后，培养基中残存的活菌个数(个/mL)，也称为杀菌程度。若要求灭菌后绝对无菌，即Ns=0，则从对数残留方程式可以看出，灭菌时间t将等于无穷大()，这是不可能的，也是不必要的。因此，要设计一台杀菌设备，必须确定在给定的发酵中所允许的残余污染度。也就是说，培养液灭菌后，以在培养液中还残留一定的活菌数来进行计算。工程上，通常可设Ns=10-3个/罐，即微生物污染降低到被处理的1000罐中只残留一个活微生物的程度，此数已满足生产的要求。故实际计算时，只要求出Ns=10-3时的杀菌时间即可。,3、污染菌的热死特性：一般在设计时需要了解残留活菌数N与杀菌温度T和时间t的关系。某种最耐热的细菌芽孢，在121时的K值只有0.4min-1。如用这个数值计算灭菌温度和时间，将使温度和时间增高很多。由于这种最耐热的芽孢一般很少发现，所以在灭菌计算时不是把所有细菌当作最耐热的芽孢来考虑，而是用一般耐热的细菌芽孢的K值来计算这个过程。如果培养基中含有较多量的这种耐热细菌芽孢，那么常规的121灭菌温度是不够的，要将其提高到接近140方可。通常设计时可设在115.5的芽孢，K孢子=11min-1，在115.5的细胞，K细胞=10min-1。一种枯草芽孢杆菌FS5230的芽孢在较高温度下，其K值与温度T之间具有如下关系：K=Ae-E/RT=7.941038e-68700/1.98T,4、培养罐中温度与时间的关系：少量培养液的杀菌，其升温到杀菌温度的时间以及维持规定的杀菌时间后的降温时间可以忽略。但在大量培养液的分批灭菌时，加热和冷却所需的时间相当长，发酵罐容积越大，时间越长。这两段时间实际上也起灭菌作用，不可忽视，以防止因过度杀菌而引起培养液中有效成分的过度损失。所以，总的灭菌时间t应等于加热时间(升温)时间t1、维持(保温)时间t2和冷却(降温)时间t3的总和。,V总=V加+V保+V冷,V：灭菌准数或杀菌值，表示灭菌效果,第四节连续灭菌及其计算,将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入发酵罐的杀菌方法就是连续灭菌法。连续灭菌优点很多，例如可以采用高温短时，使培养基养分破坏减少到最低限度，从而增加了生产率；蒸汽负荷均匀，便于自动控制；由于总的灭菌时间较分批灭菌短，缩短了发酵周期；降低了劳动强度等等。因此，培养基的连续灭菌已日益受到重视。对于粘度过高或固体成分较多的培养基，要实现连续灭菌困难较多，主要是灭菌的均匀度与管道堵塞问题。设计这类物料的连续灭菌设备必须避免管道过长，或尽可能将淀粉质培养基先行液化。,一、连续灭菌流程连续灭菌因加热和冷却设备的不同，可有各种流程形式。一般在连续灭菌时，应尽量采用新型的热交换设备，以缩短升温和杀菌后的冷却时间。1、连消塔喷淋冷却流程这是国内味精厂曾普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连消塔与蒸气直接混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器冷却至一定温度后进入发酵罐。该流程是比较陈旧的设计，设备较庞大；维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生局部过热或灭菌不足的现象；喷淋冷却管道很长，对于粘度较高、固形物含量较多的培养基极易堵塞。为了提高热量利用和节约冷却水，可采用一台套管式换热器或板式换热器置于维持罐及冷却器中间，使生培养基与热培养基先进行一次热交换，得到预热后再进入连消塔。,2.喷射加热-真空冷却流程生培养液先用泵打入喷射加热器，以较高速度自喷咀喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进入管道维持器，经一定时间后通过一膨胀阀进入真空闪急蒸发室，因真空作用使水分急剧蒸发而冷却，再进入发酵罐冷却到接种温度。优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成份破坏少。,2.薄板换热器连续灭菌流程被广泛应用于食品、发酵、制药、化工部门作为加热、冷却或灭菌之用。如：啤酒厂用于麦芽汁冷却，果酒厂用做葡萄酒灭菌和冷却。优点：设备紧凑、占地面积小、拆洗方便、传热面积和传热系数高、不使热敏性物料产生局部过热现象等。生培养基进入板式换热器的加热段与熟培养液进行一次热交换达到预热，然后进入加热段加热到灭菌温度后引入维持器保温。同时可再次用于预热，并自身冷却。,二、连续灭菌计算连续灭菌过程中，加热和冷却所需时间极短，为简化计算，可以把加热和冷却阶段的灭菌效果略去不计。直接蒸汽连续灭菌设备的温度与时间的关系，取决于所涉及的实际灭菌问题，由于受热时间短，温度可升高至140而不致严重破坏培养基。采用连消塔时可在2030S达到预定灭菌温度，由维持罐来保持必要的杀菌时间；灭菌温度和时间应根据培养基的性质和污染程度来决定。例如，谷氨酸发酵培养基粘度低、营养丰富，故灭菌温度可低些，目前生产上一般多采用110115保温810min。灭菌时间主要是维持段(维持罐或维持管)中停留的时间。,如果已知原始污染度N0以及在灭菌温度下微生物死亡反应的速度常数K，略去加热和冷却阶段的灭菌效果，则根据式就可以求出连续灭菌过程所需的维持时间t2，根据流量和维持时间t2可定出维持罐的装料容积。,例题一台连续灭菌设备流量Q=6m3/h，发酵罐装料容积40m3，原始污染度105个/mL，要求灭菌程度Ns=10-3，灭菌温度T=125，此时的K=11min-1。试求维持时间t2及维持罐的装料容积V约需多少?解N0=(40106)105=41012每分钟灭菌物料体积（维持容积）V=（Q/60）t2=(6/60)3.26=0.326m3罐式维持器不能保证物料先进先出，所以如果采取以上计算所得的维持时间和容积，则可能有一部分物料未达到所要求的灭菌程度而过早流出，为了安全起见并根据实践经验采用维持时间t2=5min，则：V=(6/60)5=0.5m3,2、维持管管道维持器的设计，不但要保证所要求的维持时间，而且要使物料在管道中的流动形式尽量接近活塞流，即管道截面各点的流动速度相等。在这种情况下，液体在维持段平均停留时间恰好等于所有培养基的受热时间，故能避免因局部过热而造成营养成分破坏或灭菌不足的现象。,第五节灭菌问题的讨论,一、培养基的灭菌条件是采用分批灭菌，还是采用连续灭菌，这与培养基的性质有很大关系。在氨基酸发酵中，大容积的培养基采用连续法消毒比间歇法消毒更为优越。在抗生素发酵中，间歇法也许是可行的，因为要使用不溶性的培养基成分，如黄豆饼粉或碳酸钙等。而氨基酸发酵则采用可溶性成分，例如朊、甜菜糖蜜、淀粉水解液或黄豆饼粉水解液，因此，可以有效地使用连消装置。采用连消法的优点是节能，消毒效果好，易控制，有利于提高产率。不过，国外通过改进发酵罐结构使得大罐也多采用分批灭菌的方法值得重视。,另一个需要探讨的问题，是必须考虑加