液相色谱基础.ppt

液相色谱的方法开发,方法开发的过程,Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.2,第一步干什么?,想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献，如Dionex,Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品,分析时要了解哪方面的情况？,灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,分离(制备)时要了解哪方面的情况？,要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成?,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）,选择HPLC检测器,对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距,用于HPLC的检测器,没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！HPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（Solutepropertydetectors）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）整体性质检测器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）,不同种类的检测器的分类,理想的HPLC检测器,高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性,灵敏度：信噪比,灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度/均一性,6:1,N,S,选择液相色谱的检测器,要考虑的因素：你要分离的化合物/样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度灵敏度需求是否有双检测的需求,选择液相色谱的检测器,通用检测器RIELSDMS灵敏度ugngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是,选择性检测器ABSFLECCondMS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是,液相色谱的检测器,常规检测器示差折光检测器（RefractiveIndex）紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis）荧光检测器（Fluorescence）蒸发光散射检测器（EvaporativeLightScattering）其他检测器（OtherDetectors）高端检测器光电二极管矩阵检测器（PhotodiodeArray）质谱检测器（MassSpectrometry）,示差折光（RefractiveIndex）检测,示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质非特异性任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值,示差检测器基本原理,检测基于被分析物的折光指数的差异测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别（DifferentialRI）典型的应用领域没有紫外吸收、荧光的化合物，例如：碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers）脂肪酸（FattyAcids）及油脂类（Lipids）,示差检测器的优、缺点,优点通用检测器容易使用；通常来说是比较耐用的检测器维护成本低缺点灵敏度低、选择性差对流速、温度及粘度的变化敏感不能用于梯度方法色谱峰可能是正的，也可能是负的,吸光度（AbsorbanceUV/Vis）检测,目前实验室中最流行的选择多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA）测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大,吸光度检测器（UV/Vis）优点,这种检测器简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以,吸光度检测器（UV/Vis）缺点,由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：用截止波长以上至少510nm作为工作波长缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响,背景吸收的影响,背景吸收降低了线性范围多数流动相有紫外吸收,荧光（Fluorescence）检测,发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光,基态,激发态,S1,S0,激发（1）,振动能（2）,发射（3）,1.分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。2.电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。3.电子失去能量达到基态时发出荧光共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象,荧光检测器原理,荧光检测器的应用,环境中的污染物多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、饮料食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素染料维生素及衍生氨基酸生物技术及制药,氨基甲酸酯类杀虫剂,黄曲霉毒素,多环芳烃（PAH）,维生素,光电二极管矩阵（PhotoDiodeArray）,PhotoDiodeArray简称：PDA或DAD,PDA检测器特点,三维水平的吸光度检测器,二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的在整个UV-Vis带宽上检测吸光度都需要相应的软件进行数据的分析,PDA检测器的用途及要求,光电二极管检测器可以提供许多又用的功能光谱信息色谱峰纯度谱库拟合像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要：高的信噪比；好的线性另外；还需要：光学分辨率光谱灵敏度及光谱分析软件,光学分辨率（带宽）,好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息,方法开发一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k值改变保留值调节a值改变选择性通过改变流动相的pH值，使样品成中性加入“对离子”，使样品呈中性调节柱长度改变柱效及分离速度,反相色谱的方法开发,开发过程实例色谱条件色谱柱：C18，4.6mm15mm流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：1ml/min样品：对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben),1.改变容量因子K,谱图,通过改变流动相改变，同样强度的不同溶剂改变色谱柱,2.改变分离因子,3.离子抑制色谱实例,而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离使样品成中性适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内,4.离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型季铵盐、叔胺盐（正离子），适用于弱酸烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同,方法开发的其他因素,流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的最佳流速样品的进样量(浓度)对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速,液相色谱的方法开发,梯度方法,液相色谱泵,稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成有效的流速范围制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑滞后体积梯度分析更为关注目的：在任何情况下保持最高精度,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度：高压混合,高压梯度使用多台色谱泵，在泵后混合配置灵活、简单，脱气简单易调节梯度的滞后体积,梯度：低压混合,低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当，梯度的准确性受影响滞后体积（系统体积）设计合理,梯度滞后：系统体积的影响,注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为14ml（戴安的4元泵400l，高压泵5%/ml,5%/min2.5ml/min-2%/ml,Solventsmustbepureorghostpeakswilloccur.Makecertainthebufferissolubleatfinalgradientmobilephasecomposition.Allowtimeforcolumnreconditioningbetweenruns.,GhostPeaks,0%MeOH,100%,梯度洗脱的实际考虑,对于下列应用，梯度洗脱可能不适合:使用强保留添加剂的应用.离子对色谱应用在裸硅胶柱上的正相HPLC,Blankrunproducingghos