11.20 分生实验报告 质粒DNA的提取、纯化与鉴定

实验4质粒DNA的提取、纯化和鉴定体外DNA重组技术实验原理在分子水平上，根据人们的需要，人工获得感兴趣的目标基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组分子转入受体细胞，筛选出能够表达重组DNA的活细胞，纯化并扩增成克隆。实验步骤1.分离或合成目标基因和感兴趣的载体-fen2.载体切割法构建和转化脱氧核糖核酸3.体外重组靶基因和载体DNA4.将重组DNA导入受体细胞5.阳性重组体的筛选、鉴定和扩增-筛选预防措施目标基因的获得：1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.逆转录基因合成cDNA4.从基因组文库中筛选目标基因5.聚合酶链反应采集载体的选择：1.它能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一起扩增；(2)具有适合克隆的限制性位点；3.有一定的筛选标志，易于识别和筛选；4.载体分子应该尽可能小，并且可以插入大的外源DNA而不影响复制。5.表达载体应配备调控元件，如启动子、前导序列、增强子等。适合宿主细胞；6.良好的生物安全性。质粒DNA的提取实验原理质粒是细胞质中独立于染色体并能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它能随着细菌细胞的分裂将其遗传特性稳定地传递给后代细胞。除了与复制和转录相关的必要序列外，质粒中的一些DNA片段不是细菌必需的序列。通过体外操作用目标基因替换这些不必要的片段，修饰的质粒成为外源基因载体。根据质粒载体的使用及其外源基因的遗传信息是否能被表达，可将其分为中间克隆载体(如pMD18-T)和表达载体(如pET-X、pBI121等)。)。与克隆载体相连的DNA片段通常没有启动子，因此它们不能被转录，主要用于靶片段的大量制备。根据不同的宿主，表达载体包括各种原核表达载体(例如大肠杆菌)和真核表达载体(例如酵母、动物和植物)。目标基因在载体上具有完全的启动子和终止子调节，并且可以在宿主细胞中转录和翻译成蛋白质。根据质粒在宿主细胞中复制的不同调控机制，可分为两种类型：一种是“松弛”质粒，如pMB1/colE1复制子，其复制受一种称为RNAII的分子正调控，该分子不需要质粒编码的任何蛋白质，完全依赖于宿主提供的长寿酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加抗生素如氯霉素抑制蛋白质合成的条件下，其复制也不会停止；第二，“紧密”质粒的复制，如pSC101，伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白合成被阻断，其拷贝数不能增加，即复制是在宿主的“紧密”控制之下。在分子生物学研究中，为了快速扩增和提取大量质粒DNA，通常使用“松弛”质粒。然而，由于某些特殊原因(例如表达产物对细胞有毒)，需要严格的质粒。配置：超螺旋结构结构紧凑，运行速度快。电泳是最快的。开环OC -最大容量，不容易通过胶孔。线性液晶中心。质粒DNA碱裂解提取原理：基于质粒DNA和染色体DNA变性和复性的区别。也就是说，质粒DNA被溶液、和分离和提取。当PH=12.6时，染色体DNA完全变性，质粒DNA没有完全变性。在PH=4.8时，质粒DNA复性，但染色体DNA不能。质粒DNA沉淀在约67%体积的无水乙醇中。70%乙醇起洗涤作用。预防措施1、质粒DNA提取过程应温和，以免对DNA造成损伤2.加入溶液后，悬浮菌体将完全分散3.加入溶液后，贮存时间不应超过5min，以防4.加入溶液后，液体由浑浊变为透明粘稠，出现拉丝现象。如果没有出现上述现象，实验将无法继续，在重新开始之前，应检查试剂制备和操作是否有错误。5.提取后应尽可能干燥质粒，因为残留的乙醇可能会影响后续实验。6、注意轻度休克和重度休克的区别电泳技术实验原理带电粒子在电场作用下向电性质相反的电极移动的现象称为电泳。带电荷的生物分子可以在电场的作用下移动。由于混合物中各组分的电荷性质、数量和分子量不同，在同一电场作用下，各组分的游动方向和速度也不同，因此在一定时间内各组分的移动距离不同，从而达到分离和识别的目的。在一定的酸碱度条件下，每个分子都有特定的电荷(类型和数量)、大小和形状。在一定的时间内，它们在相同的电场中以不同的速度运动，集中在特定的位置，形成一个紧密的游泳带。这是带电粒子可以通过电泳分离、分析和识别的基本原理。琼脂糖凝胶电泳是常用的。通常用于核酸分离和分析。琼脂糖凝胶的孔径很大，对大多数蛋白质只有很小的分子筛效应。优势：1.双重效应：电泳效应和分子筛效应。2.操作简单，电泳速度快，样品无需预处理。3.电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。4.凝胶是透明的，没有紫外线吸收，结果可以在紫外线灯下观察。5.易染色、易洗脱、易定量。核酸分子的迁移率由以下因素决定：(1)1)脱氧核糖核酸的分子大小。线性双链DNA分子在一定浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率与DNA分子量的对数成反比。分子越大，阻力越大，在凝胶孔隙中移动越困难，因此迁移越慢。(2)2)脱氧核糖核酸分子的构象。当一个DNA分子处于不同的构象时，它在电场中的移动距离不仅与其分子量有关，而且与其构象有关。相同分子量的线性、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中以不同的速度移动，超螺旋DNA移动最快，而开环DNA移动最慢。当通过电泳鉴定质粒的纯度时，如果由于质粒DNA的不同构象或由于含有其它DNA而难以确定凝胶上是否有几个DNA带，则可以从琼脂糖凝胶中一个接一个地回收DNA带，分别用相同的限制性内切酶水解，然后进行电泳。如果凝胶上出现相同的DNA模式，那就是相同的DNA。(3)电源电压。在低电压下，线性DNA片段的迁移率与施加的电压成正比。然而，随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将在不同的范围内增加。碎片越大，电场强度增加引起的迁移率增加越大。因此，琼脂糖凝胶的有效分离范围将随着电压的增加而减小。为了最大化大于2kb的DNA片段的分辨率，施加的电压不得超过5v/cm。离子强度的影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子的情况下(例如，误用蒸馏水制备凝胶)，电导率极低，并且DNA几乎不移动。在高离子强度的缓冲液中(如误加10倍电泳缓冲液)，电导率很高，明显发热，严重时会导致凝胶融化或DNA变性。实验结果上图是实验数据。1；pGEX-2TX-SP1电泳结果显示两条条带，即较不明显的核糖核酸条带和较明亮明显的超螺旋脱氧核糖核酸条带。2；PUC18电泳从左到右显示四条条带，即核糖核酸条带和超螺旋脱氧核糖核酸条带。线性DNA带和开环DNA带。结果分析1.核糖核酸电泳带的原因：当加入溶液时，3.线性DNA带和开环DNA带出现的原因：在提取过程中，振荡过于强烈，导致DNA开环。全面审查和分析突出显示零件1.因为以前有过移液器的操作经理，移液器的操作符合规范。2.溶液二现在可以使用了，应该在室温下保持不超过5分钟。加入溶液二和三后，将溶液混合均匀。3.注意移液器范围的选择。4.加入氯仿后的上清液不与Pr变形层混合。5.离心机的使用符合规范，时间受到严格控制。6、每次有药品更换时，严格更换枪头，防止试剂污染。7.加入70%的乙醇，洗涤，离心并充分干燥，然后加入TE不足部分1.首次添加溶液时，移液枪的测量范围选择不正确，导致小组实验重新开始。2.在某些移液步骤中，试剂可能会粘在管壁上。3、猛烈的冲击可能太短，不够深。