第三章-毛细管电泳分离技术.ppt

第一节概述,电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒，它们所在的介质受到外加直流电场的作用下，其迁移速率不同而得到分离的一类方法。（electrophoresis）,发展历程,1807年，FerdinandFredericReuss就观察到了荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。1909年，由Michaelis对此现象的描述中提出电泳这个术语(elektron和pbore,分别代表电和搬运者的意思)20世纪30年代，通过Tiselius的研究，电泳技术才得到有实际意义的发展，Tiseluis也因此获得了1948年度的诺贝尔奖。到20世纪50年代，电泳已经是一种与纸和薄层的平面色谱技术一样的实验室常用技术。20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术成为了一种“灰姑娘”式的技术,1981年，Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技术。1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。1991年，Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物的分离分析方面也取得了重大进展。,第二节毛细管电泳基本原理,一、毛细管电泳的理论基础毛细管电泳法：是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和/或分配行为的差异而实现分离的一种分析方法。在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力：电泳力电渗力,（一）电泳和电渗,电泳(Electrophoresis)是指溶液中带电粒子(离子、胶团)在电场中定向移动的现象。电泳是驱动电解质运动的第一种动力。电泳迁移速度Ve:Ve=eE=eV/L注：e:电泳迁移率(电泳淌度);E:电场强度;V毛细管柱两端施加的电压；L毛细管柱的长度。e=e/E=Q/f,当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液的粘度及带电离子的大小有关。,注：Q离子所带的净电荷；fStokes阻力系数。是缓冲溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂化层),电渗(Electroosmosis)是驱动电解质运动的第二种作用力，它使毛细管中的溶剂在直流电场作用下发生定向运动。,电渗流的产生,毛细管内壁表面上的硅醇基在pH3的水溶液中，可电离而产生SiO-负离子，使毛细管内壁带上负电荷，因此，溶液中的一部分正离子就靠静电作用而吸附于毛细管内壁上，形成一个双电层(Electricdoublelayer)。其中一层是带负电的内壁，一层是带正电的溶液离子吸附层。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远，越呈自由状态，于是在吸附层之外又存在着一个扩散层。,固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与扩散层之间的滑动面上，此处的电动势称为界面电动势，也称电位。由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用，它在电场中发生迁移时，将带动整个溶液向阴极移动，所以就形成电渗流（ElectroOsmoticFlow,EOF）。,电渗流速度Veo与电位、E成正比，而与介质的粘度成反比。,电渗流迁移率,介质的介电常数,界面电动势,介质的粘度,溶剂流迁移速度,与HPLC柱不同，毛细管中的电渗流呈平面流型，它不存在径向梯度。,电渗流的意义,电泳过程中伴随着电渗现象电渗流的速度比电泳速度快5-7倍利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。,电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之和。,Vi=Ve+Veo,当把样品从阳极端注入毛细管时，假设A物质为负离子，B物质为正离子，则带不同电荷的离子将按下面的速度迁移到阴极，到时间t时，A、B物质已经分离了。正离子：t=eo+中性分子：t=eo负离子：t=eo-,注：电渗流的速度为泳流的若5-7倍,抑制毛细管中电渗流的办法：消除固液界面间的电位或提高溶液的粘度；在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂层。具体方法有：,电渗流是毛细管电泳分离的重要参数，控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度,(二)分离效率和分离度,1、分离效率柱效可用理论塔板数n表示,理论塔板高,毛细管电泳分离柱效方程式,实验上可按下式求出理论塔板数,毛细管有效长度,毛细管总长度,两端电压,溶质扩散系数,电泳湍度,电渗湍度,电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离,电泳峰的半高峰宽,提高分离电压是增加分离效率的主要途径，在相同的操作电压下，l/L=1，分离效率最高（短的毛细管）。此外，N与溶质的扩散系数D成反比，所以用毛细管电泳分离大分子时，可得到高的柱效。高的电渗流也可提高柱效。,毛细管电泳分离柱效方程式,2、分离度电泳中两峰的分离度，也称分辨率，它表明湍度相近的组分分开的能力，可表达为（和哪些因素有关）：,柱效,相邻两区带的迁移速度差,两者的平均速度,表示分离的选择性,分离度计算式（具体如何计算）:,组分迁移时间,峰底宽度,（三）区带宽度及展宽因素,1、各组分都有相近的空间宽度毛细管电泳里有电渗流，泳动是平头的，几乎不扩散，不管什么时间测峰，区带宽度几乎是相等的，这跟液相色谱是不一样的。,2、区带宽度展宽因素,毛细管电泳分离中，各组分区带因各自的电迁移速度不同而被分离，同时在迁移过程中也会发生区带展宽，影响迁移速度相近物质间的分离。,焦耳热,进样,电泳扩散,毛细管壁对组分的吸附,（4）电泳扩散试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带分散。,二、毛细管电泳的分离模式,毛细管区带电泳(CZE)胶束电动毛细管电泳(MECC)毛细管凝胶电泳(CGE)毛细管等电聚焦(CIEF)毛细管等速电泳(CITP)毛细管离子电泳(CIE)毛细管电色谱,原理,分离过程,1、毛细管区带电泳(CZE),毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)是毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它操作模式的母体。分离原理：由于各组分间荷质比的差异，混合组分处在背景电解质溶液中，在外加电场作用下便获得分离，即CZE是基于溶质的湍度差异进行分离的。,2、胶束电动毛细管电泳(MECC),胶束电动毛细管电泳（micellareletrokineticcapillarychromatography,MECC）是以胶束为假定固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合。它是在电泳缓冲溶液中加入高于胶束临界浓度（CMC）的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），其疏水基团聚集形成胶束，基于各组分溶质在水相和胶束之间的分配系数不同，而获得分离。不仅能分离离子化合物，还能分离中性化合物。,分离过程：在电场作用下，体相溶液在EOF带动下流向阴极，表面带负电荷的胶束泳动方向与EOF方向相反，一般EOF速度大于胶束泳动速度，因此胶束净迁移向阴极。溶质在流速大的体相水溶液和流速相对较缓慢的假固定相胶束间进行分配。,3、毛细管凝胶电泳(CGE),毛细管凝胶电泳：它是用多孔性的凝胶或其他筛分剂作介质，因凝胶的网状结构类似于分子筛的作用，流经凝胶的试样，按分子的大小分离。,筛分剂,凝胶材料：化学共价或交联方式形成的胶状多孔物质，成型后很难改变。聚丙烯酰胺凝胶葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶非凝胶材料：缠绕的聚合物以物理方式组成的物质，较易随容器不同改变形状。甲基纤维素,优点：1、毛细管凝胶电泳分离度极高。电泳技术和平板凝胶电泳的结合。2、电泳峰尖锐，柱效极高。凝胶黏度大，抗对流，溶质扩散减少，限制了谱带展宽。3、组分在短柱上能有极好的分离。溶质与凝胶可形成络合物，增加了分离度，防止了溶质在毛细管壁的吸附，减少了电渗流。缺点:制备柱较困难，寿命较短。,毛细管凝胶电泳优缺点,4、毛细管等电聚焦(CIEF),CIEF：是建立在不同蛋白质或多肽之间等电点差异基础上的分离方法。分离两性电解质，分辨率高（区分0.01pH）。蛋白质的等电点（PI）：指蛋白质的分子的表观电荷数为零时的pH值。方法是按进样等电聚焦检测三步进行,蛋白质与两性溶液混合进样,蛋白质与两性溶液混合进样,1、施加电压，两性电解质迁移，在毛细管柱中形成pH梯度2、被分离物质迁移至其等电点的pH区域，停止移动,注意：电渗流的存在会破坏稳定的聚焦区带。解决方法：通过管壁涂层使电渗流减少到最小，可防止蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带。,第三节毛细管电泳装置,直流高压电源、毛细管、进样装置、检测器和记录仪等,高压电源可对毛细管施加550kV电压，操作电压一般控制在530kV范围。CE通常使用内径10100m、长12120cm(内涂聚酰亚胺)弹性融凝石英毛细管，毛细管的两端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管内也充满同样的缓冲溶液。被分离试样可以采用流体动力学进样和电动进样方式由毛细管一端进入。,一、毛细管电泳的进样技术,毛细管内径小于100m时，注射器进样比较困难。（一）电动进样（二）流体动力学进样,（一）电动进样,三步：毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测段的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成缓冲液，电泳即可进行。改变进样电压和进样时间，便可改变进样量。,（二）流体动力学进样,流体动力学进样：也称虹吸进样、重力进样和压差进样。将毛细管插入试样溶液容器，通过进样端加压，或调节进样端试样溶液液面高于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，试样在压力差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。,二、毛细管电泳检测器,由于样品区带在高压电场作用下，迁移速度较快，因此，CE要求所用的检测器必须具有很快的响应速度和很高的灵敏度。光学检测器（紫外检测器和荧光检测器）电化学检测器质谱检测器核磁共振检测器,紫外检测器,根据比耳定律，光度测量值A与吸收光程成正比。一般检测中，检测最大光程是用毛细管内径，而毛细管内径增大受焦耳热影响的制约，因此采用细内径毛细管柱时，测量灵敏度受到限制