急性经口毒性试验

急性经口毒性试验AcuteOralToxicityTest,一、实验内容,1、动物的称重、编号、随机分组；2、受试物的配制（等容量稀释）；3、小鼠灌胃染毒操作技术；4、急性毒性反应观察；5、LD50（机率单位法）的计算和毒性分级。,二、材料和试剂,1、实验动物选用健康成年小鼠（1822g）。试验前要对动物饲养观察37天，以适应饲养环境，并淘汰不健康或体重不符合要求的动物；2、器材动物秤，注射器，灌胃针，体重称，吸管，吸球，容量瓶，烧杯，棉棒，试剂瓶；3、试剂DDV（80g/100ml），苦味酸，蒸馏水。,三、操作步骤,（一）实验动物与分组首选健康成年小鼠(1822g)和大鼠(180220g)，也可选用其它敏感动物。同性别实验动物个体间体重相差不得超过平均体重的10%。本次试验取体重1822g的小鼠，试验时，将小鼠称体重、编号、按随机分组原则，将实验动物分成5组，每组8只。,动物编号染色法,1,2,6,3,9,7,8,5,4,（二）剂量选择,首先了解受试化学物的化学结构和理化性质，查阅与受试化学物结构及理化性质相近似的其它化学物毒性资料（LD50），以此值作为受试化学物的预期毒性中值，即中间剂量组。上下各推12个剂量组，进行预试验。注意，动物种系和给药途径相同的毒性资料才可用作预期毒性中值。LD0、LD01、LD100。,各剂量组的间距可根据LD50计算方法要求按等比级数或等差级数安排。本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级数排列，常用1：0.8，如敌敌畏的最高剂量为125mg/kg，其次剂量组为125mg/kg0.8=100mg/kg，依次类推为80、64和51.2mg/kg五个剂量组。,（三）受试化学物配制与稀释,1、溶剂水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶液，脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、植物油、淀粉等配制成混悬液。,2、受试物的配制（等容量稀释）根据计算结果精确量取需要的受试物的量，稀释成需要的浓度。,配制步骤,取1.5625mlDDV，用水稀释至100ml，浓度为12.5mg/ml，为（1）液；取（1）液80ml，稀释至100ml，浓度为10mg/ml，为（2）液；取（2）液80ml，稀释至100ml，浓度为8mg/ml，为（3）液；取（3）液80ml，稀释至100ml，浓度为6.4mg/ml，为（4）液；取（4）液80ml，稀释至100ml，浓度为5.12mg/ml。按10ml/kg体重经口灌胃小鼠，则染毒剂量分别为125、100、80、64、51.2mg/kg。,（四）灌胃,1、灌胃量实验试验前实验动物应禁食（一般1216h），不限制饮水。然后对各组动物用经口灌胃法一次染毒。一次灌胃液体积为小鼠0.21ml，大鼠14ml，豚鼠l5ml，染毒后继续禁食34h。各剂量组动物给予受试物的体积均为10ml/kg。不同体重小鼠灌胃容量计算：小鼠灌胃容量V(ml)=体重(g)10(ml/kg)=体重(g)10ml/1000g,2、灌胃操作,小鼠、大鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后皮肤，无名指或小指将尾部紧压在手上，使小鼠腹部向上，尽量使其体位垂直，注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持连着灌胃针的注射器，将灌胃针由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即深入至胃部，随后将受试物溶液注入。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。一般进针深度小鼠2.54cm，大鼠或豚鼠46cm。,（五）实验观察,实验动物灌胃后应详细观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒和死亡情况。高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡时间及死亡前的特征。根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。观察期（14天）结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。,三、LD50计算,可采用多种方法测定LD50，有机率单位法、霍恩氏法、寇氏法等，机率单位法数字基础较好，能计算出任何反应率水平的剂量，且实验2-5组均可。机率单位法要求：1、剂量按等比级数排列，相邻两剂量组间的比值常用0.8；2、各实验组动物数相等。,机率单位法计算公式（五个剂量组时）,X3-为第三个组的剂量对数(X3=log80，80mg/kg)i-为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数(i=log(1/0.8)y-为死亡率相应的机率单位（查表）1、2、3、4、5为小剂量组到大剂量组的顺序。yK-为50%死亡率时所相当的反应率的机率单位，计算LD50时，yK=5.0,+X3,四、结果评价,根据实验动物中毒体征、死亡时间和特征、LD50，按受试物种类急性毒性分级标准进行评定，判断该受试物的毒性大小及毒性特征。,急性经口毒性分级标准（WHO）,五、作业,实验报告,六、注意事项,1、灌胃时操作要熟练，以免损伤食道或误入气管2、正确捉拿动物，防止咬伤且避免动物损伤3、灌入量计算和操作要准确，否则影响结果4、防止操作者中毒。注意通风，不要把药