基因表达的定量检测分析PPT参考课件.ppt

基因表达的定量检测分析，1，基因表达的定量检测方法1。蛋白质表达水平检测：1)定量检测和分析：westernblotting、ELISA、HPLC2)蛋白质功能分析：蛋白质子细胞位置分析：免疫荧光技术蛋白质相互作用研究：酵母双杂交、免疫共渗(IP)、荧光共振能量传递基本步骤如下：1 .整个mRNA的分离2。根据RNA的大小，通过琼脂糖凝胶电泳分离RNA。3 .RNA作为固相支撑物(尼龙薄膜)传输，在全过程中，要保持凝胶中RNA的相对分布，则为4 .在支撑物中固定RNA(UV交联)5。固相RNA和探针分子(DNA或RNA)杂交6。固相载体上非特异性结合的探针分子去除7。检测、捕获和分析特异性结合探针分子的图像，3，3，RealtimePCR，4，4，1996年美国AppliedBiosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，不仅实现了PCR定性-数量的飞跃，还实现了现有PCR的定性-数量飞跃5、实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术是指通过Ct值与标准曲线或内部参考基因的关系，将荧光组添加到PCR反应系统中，实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物的数量变化，定量分析起始模板的方法。与现有PCR技术相比：量化和定性分析PCR放大反应的端点产物，无法准确量化起始模板，无法实时检测放大反应。6，一般而言，荧光放大曲线可以分为荧光背景信号阶段、荧光信号指数放大阶段和平台期间三个阶段。7，荧光背景信号阶段放大的荧光信号被荧光背景信号掩盖，无法确认产品量的变化。在平台，扩增产物不再呈指数增长。PCR的最终产物量和起始模板量之间没有线性关系，因此无法根据最终PCR产物量计算起始DNA拷贝数。仅在荧光信号指数放大阶段，PCR产品正对值和起始模板量之间存在线性关系，在此阶段，可以选择进行定量分析。为了便于量化和比较，实时荧光定量PCR技术引入了荧光阈值和CT值两个非常重要的概念。荧光阈值是在荧光信号指数放大阶段随机设置的值，但是使用荧光域值的默认设置，该值通常是3-15周期荧光信号标准偏差的10倍。CT值，8，几个常用名词概念，1。Ct值的定义c为Cycle，t为threshold(阈值，阈值)，Ct值的含义是每个反应管内荧光信号达到设置阈值时所经历的循环数。9，2。设定荧光域值(threshold)的PCR反应的前15个周期的荧光信号用作荧光背景信号，荧光域值的默认设置是荧光信号相对于3-15个周期的标准偏差的10倍。也就是说，threshold=10SDcycle3-153。对Ct值与起始模板之间关系的研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始副本数的日志具有线性关系，起始副本数越多，Ct值越小。使用标准产品(称为起始副本数)，水平坐标可以表示起始副本数的对数，而纵坐标可以创建表示Ct值的标准曲线。因此，当获得未知采样的Ct值时，将在标准曲线上计算该采样的起始副本数。，10，使用前15个循环信号作为荧光背景(baseline)荧光阈值的默认设置为3-15个周期荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：荧光背景和比语音控制组大的荧光峰值；指数周期的初始阶段，11，绝对定量分析：对数模板起始浓度和Ct值应线性关系，12，质粒提取，od值定量，将质粒梯度稀释用作标准品，13，14，相对定量分析应校准为内部控制基因(假设基因)，并进行相对表达分析。管家基因：维持GAPDH、Actin、HPRT等细胞基本代谢活动所需的基因，15、16、17、18、19、20、21、22缺点：非模板特异性，引物特异性要求比较高，不能进行多重定量分析，25，26，27，TaqMan probe，molecular beacon，低背景荧光，28，反应优化，PCR反射效率低时，可以使用三级PCR放大。染料方法