第一代测序技术.ppt

测序技术、Kalibinur Ayiti应用微生物、目录、第一代测序技术、第二代测序技术(Illumina sequencer、SOLiD sequencer、454基因组测量、离子测序)、第三代测序技术、高通量测序技术、第一代测序技术的发明者，以及通过使用DNA聚合酶和双脱氧链终止来确定DNA核苷酸序列的方法。它是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家弗雷德桑格和他的同事于1997年发明的。第一代测序技术、传统的链终止法、化学解释法以及基于它们的各种DNA测序技术已经成为第一代DNA测序技术。原则上，第一步是在每个分子的相同位置退火短寡核苷酸，然后寡核苷酸作为引物合成与模板互补的新的DNA链。使用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需的3-羟基，因此可以用作链终止试剂)通过聚合酶的引物延伸产生一系列不同大小的分子，然后分离。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用脱氧核糖核酸延伸引物。延伸反应分为四组(如下图所示)。每组由四个ddNTP(双脱氧核苷酸)中的一个终止，然后用PAGE分析四组样品。我们需要的序列可以从获得的PAGE胶中读出。一共有四组试剂，第一组含有A、T、C三个脱氧核苷酸，G这种双脱氧核苷酸，测序是根据核苷酸在一个固定点，在一个特定碱基上随机终止，并在每个碱基荧光标记后，产生A、T、C、G四组不同长度末端的一系列核苷酸，然后在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测，从而获得可见的DNA碱基序列。桑格测序法的原理是，每一个反应都包含用于扩增的所有四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)和用于终止的有限数量的不同双脱氧核苷三磷酸(dNTP)。因为dNTP缺少延伸所需的3-羟基，延伸的寡核苷酸选择性地终止于G、A、T或C，终止点由反应中相应的双脱氧决定。每个脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸的相对浓度可以调节，以获得一系列长度相差一个碱基的片段。它们有一个共同的起点，但终止于不同的核苷酸。不同大小的片段可以通过高分辨率变性凝胶电泳分离。凝胶处理后，可通过x光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。作为新一代DNA测序仪的代表，大规模并行测序平台(massivelyparallednasqueningplatform)的出现不仅将DNA测序的成本降低到以前的1%,还使得基因组测序这一以前为大型测序中心保留的“特权”被许多研究人员共享。新一代DNA测序技术帮助人们以更低的价格更全面、更深入地分析基因组、转录组和蛋白质相互作用组的数据。最近，市场上出现了许多新一代序列器产品。例如，美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国索莱克斯技术公司联合开发的Illumina测序仪、美国应用生物系统公司的固体测序仪、美国多佛/哈佛公司的Polonator测序仪和美国HeliScope公司的HeliScope单分子测序仪。所有这些新的测序仪都采用了新的测序策略循环排列测序，这也可以称为“下一代测序技术或第二代测序技术”。循环芯片测序法，即所谓的循环芯片测序法，简而言之，就是在一个充满了DNA样品的芯片上重复基于DNA的聚合酶反应(模板变性、引物退火杂交和延伸)和荧光序列阅读反应。与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作简单、成本较低的优点，因此很快得到广泛应用。虽然这些新一代定序器和芯片的实际制造过程似乎与传统定序方法大不相同，而且各有特点，但事实上它们背后的原理和技术非常相似，甚至相同(图1b)。下一代测序方法首先将基因组DNA随机切割成DNA分子的小片段，然后在体外将这些DNA分子的小片段的末端连接起来形成文库，或者使用配对标签制作跳接文库。随后，测序模板可以通过诸如原位polony(小词典1)、微乳液聚合酶链反应(乳液聚合酶链反应)、聚合酶链反应(桥聚合酶链反应)(图5)的方法获得。上述方法有一个共同点，即任何小片段的DNA分子的聚合酶链反应扩增产物都聚集在空间中：原位聚合酶链反应方法和桥式聚合酶链反应方法中的所有产物都集中在平板上的某个地方，而微乳液聚合酶链反应方法中的所有产物都集中在微珠的表面。与传统测序方法一样，真正的测序反应本身由重复的聚合酶反应和最终的荧光读数分析反应组成(图6)。本文讨论的所有测序仪都使用合成测序法(测序)，即通过聚合酶或连接酶连续延伸引物获得模板序列，最后通过收集和分析每一轮反应结果的荧光图像获得序列结果。使用Illumina测序仪来说明第二代测序的一般过程，(1)文库制备，通过原子化或超声波将DNA随机片段化成几百个碱基或更少的小片段。用聚合酶和核酸外切酶将DNA片段切割成平端，然后磷酸化并添加核苷酸粘性端。然后将Illumina测序接头连接到片段上。(2)集群创建：将模板分子添加到芯片中，用于生成克隆集群和测序循环。该芯片有一个带有8个纵向通道的硅衬底。在每个通道的芯片表面上有无数固定的单个链路头。将在上述步骤中获得的剪接的DNA片段变性成单链，然后与测序通道上的剪接的引物结合，形成用于后续预扩增的桥结构。成簇分布的数百万待测双链片段通过连续循环获得。(3)测序，分为三个步骤：DNA聚合酶与荧光可逆终止子结合，荧光标记的簇成像，结合的核苷酸在下一个循环开始前被剪切和分解。(4)数据分析。离子导入测序，离子导入个性化操作基因组测序仪(PGMTM)是第一个基于半导体技术的测序仪。与其他测序技术相比，使用该技术的测序系统更简单、更快、更容易升级。该测序仪在特性上与其他高通量测序仪互补，能够快速完成应急服务项目，缩短服务周期，提高服务效率。主要应用领域：扩增子测序、核糖核酸单链测序、基因组和宏基因组测序、测序、离子修正测序原理、鸟枪法数据库构建。在基于油包水聚合酶链反应的珠模板扩增微珠中加入测序引物和聚合酶，然后加入到测序芯片表面带有酸碱度微传感器的测序芯片中，测序芯片分别分批流过四个脱氧核蛋白，微珠表面的核酸经过合成和测序反应。每次发生聚合反应时，氢离子就会释放出来，微珠周围微环境的酸碱度也会发生变化。微电极检测酸碱度的变化，将其转化为相应的碱基信号，最终获得DNA序列。Roche454测序原理。散弹枪数据库是基于油包水聚合酶链反应微珠模板扩增微珠。添加测序引物和聚合酶后，微珠被添加到带有酸碱度微传感器的测序芯片中。测序芯片分别流经测序芯片表面的四个dNTP，微珠表面的核酸在合成的同时进行测序反应。每当发生聚合反应时，释放焦磷酸被焦磷酸酶水解，释放的光子光通过光纤传输到光学探针，光学信号被转换成碱基信息以获得DNA序列。SOLiD测序，SOLiD使用连接测序获得基于“双b固体测序原理，基于鸟枪法的油包水聚合酶链反应，在测序芯片上放置带有长DNA片段的珠子，加入四个荧光寡聚物探针进行杂交，探针上两个位置的碱基是特异性的，其他位置的简并碱基加入连接酶，将能够杂交的寡聚物连接到测序引物上洗去多余的探针，进行激光扫描观察荧光，重复步骤4-7。将获得的第一次洗去36-50个碱基延伸长度的测序延伸链进行错位，加入荧光探针，重复4-8的过程，将错位的荧光信号排列组合，得到DNA序列。高通量测序和高通量测序技术(也称为“下一代”测序技术)的应用以能够一次并行测序数十万到数百万个DNA分子和一般较短的阅读长度为标志。根据发展历史、影响、测序原理和技术，主要有以下几种：大规模平行签名测序、MPSS)、聚合酶克隆、454 PolonySequencing、Illumina(Solexa)测序、ABISOLiDsequencing、离子半导体测序、脱氧核糖核酸全球测序等。高通量测序技术是对传统测序的革命性改变，一次测序数十万到数百万个DNA分子。因此，有些文献称之为“下一代测序”，这是一个划时代的变化。与此同时，高通量测序使以详细和完整的方式分析一个物种的转录组和基因组成为可能，因此也被称为“深度测序”。实验过程，1。样本碎片)2。图书馆准备)3。顺序反应)4。数据分析、技术应用、测序技术促进科学研究的发展。随着第二代测序技术的快速发展，科学界已经开始越来越多地使用第二代测序技术来解决生物问题。这里需要特别指出的是第二代测序与微阵列技术相结合的应用靶序列捕获测序技术。目前，高通量测序已开始广泛用于寻找疾病的候选基因。以上是2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。然而，除了第二代测序之外，还有另一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术，该技术也在如火如荼地进行，但尚未正式发布。科学界现在谈论的是高通量测序，也指第二代测序。意义，高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域的一个里程碑事件。这项技术使得核酸测序的单碱基成本比第一代测序技术的成本低得多。以人类基因组测序为例，上世纪末开展的人类基因组计划花费30亿美元解码人类生命密码，而第二代测序将人类基因组测序带入了元基因组时代。如此低的单碱基测序成本使我们能够实施更多物种的基因组计划，从而解密更多生物物种基因组的遗传密码。同时，在已经完成基因组测序的物种中，也有可能对其他物种进行大规模的全基因组再测序。第三代测序技术是指单分子测序技术。在DNA测序过程中，不需要进行聚合酶链反应扩增，实现了每个DNA分子的单独测序。第三代测序技术的原理、原理主要分为两个技术阵营：第一个阵营是单分子荧光测序，代表技术是Helicos的SMS技术和PacificBioscience的SMART技术。脱氧核糖核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸掺入到DNA链中时，它的荧光可以在DNA链上同时检测到。当它与DNA链形成化学键时，它的荧光基团被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除后，合成的DNA链与天然的DNA链完全相同。第二大阵营是纳米孔测序，代表公司是牛津纳米孔公司。一种新的纳米测序方法利用电泳技术将单个分子一个接一个地穿过纳米孔。由于纳米孔的直径非常小，只允许单个核酸聚合物通过，并且ATCG单个碱基的带电性质不同，通过电信号的不同可以检测到通过的碱基类型，从而实现测序。第三代测序技术解决了关键技术。首先，当用显微镜实时记录DNA链上的荧光时，围绕DNA链的许多荧光标记的脱氧核苷酸形成非常强的荧光背景。这种强荧光背景使得单个分子的荧光检测成为不可能。太平洋生物科学公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔(零模式波导)，其中固定了一个单一的DNA聚合酶分子。在这样一个小孔中，围绕DNA链的荧光标记的脱氧核苷酸是有限的，并且由于四个荧光标记的脱氧核苷酸A、T、C和G从外面非常快速地进出孔，它们形成非常稳定的背景荧光信号。当某个荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链中时，这种特定颜色的荧光将持续一小段时间，直到形成一个新的化学键，并且荧光基团被DNA聚合酶切除。第二，共焦显微镜可以实时、快速地记录集成在板上的大量纳米孔。第三代测序技术的特点是，它实现了DNA聚合酶固有的反应速度，每秒可测量10个碱基，测序速度是化学测序的2万倍。它实现了DNA聚合酶的内在连续性，可以在一个反应中测量非常长的序列。第二代测序现在可以测量数百个碱基，但是第三代测序现在可以测量数千个碱基。其精度很高，达到99.9999%。直接测量核糖核酸的序列。由于可以实时观察到脱氧核糖核酸聚合酶，也可以使用以核糖核酸为模板复制脱氧核糖核酸的逆转录酶。RNA的直接测序将大大减少体外逆转录引起的系统误差。第二是直接测量甲基化的DNA序列。事实上，DNA聚合酶以不同的速度复制A、T、C和G。正常碳或甲基化碳是模板，而DNA聚合酶的停顿时间是不同的。根据这个不同的时间，可以判断模板C是否甲基化。应用第三代测序技术，基因组测序：由于其阅读长度长，SMRT测序平台可以减少测序后的重叠群数量，显著减少后续基因组剪接和注释的工作量，并节省大量时间。甲基化研究：SMRT技术使用的方法是实时监控DNA聚合酶的工作状态。聚合酶合成的每个碱基都有一段时间。当模板碱基被修饰时，聚合酶将变慢，因此如果被修饰碱基的两个相邻脉