化学发光免疫技术.ppt

化学发光免疫技术，第一部分发光和化学发光试剂，第二部分发光酶免疫测定，第三部分化学发光免疫测定技术，第四部分电化学发光免疫测定技术(ECLI)(电致发光免疫测定)，化学发光免疫测定：一种将灵敏的化学发光分析与特异性抗原抗体免疫测定相结合的检测技术。概念，特征：高特异性，高灵敏度，简单快速的分离，无毒，安全稳定的试剂，并且可以自动化。化学发光免疫技术的类型，根据发光剂的不同，它可分为1。化学发光酶免疫分析法(cleia)、化学发光酶免疫分析法(ECLI)和电化学发光免疫分析法(ecli)电致发光免疫分析法可分为1。微粒化学发光免疫分析2。磁性粒子化学发光免疫分析，第1节发光和化学发光试剂。1.当发光物质从电子激发态返回到基态时，释放的能量会发光。1。被照亮的：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，返回基态时发出较长波长的可见光。在荧光素酶的催化下，生物发光：反应底物利用三磷酸腺苷生产能力产生激发态荧光素，当后者回到基态时，多余的能量以光子形式释放。在室温下化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程。荧光素酶三磷酸；O2；Mg2，氧化萤火虫荧光素，萤火虫荧光素，生物发光，返回，化学发光，机理：一些化合物可以利用化学反应产生的能量使它们的产物分子或中间分子上升到电子激发态。当该产物分子或中间分子衰变到基态时，能量以发射光子的形式释放(即发光)。化学发光剂、化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子形式释放能量的化合物。发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂。它们可以参与化学发光反应；(2)与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合试剂；(3)耦合后保持高量子效应和反应功率；标记物的理化性质，尤其是免疫活性，不应改变或很少改变。化学发光剂应符合下列条件并返回。1.用于酶促反应的发光底物是指一类通过酶的降解发光的发光底物。CLEIA中常用的酶包括HRP和APHRP。鲁米诺和4-羟基苯乙酸AP用作发光基质。以1.1鲁米诺、H2O2/羟基-辣根过氧化物酶、N2H2O光、4-羟基苯乙酸(HPA)为发光底物，在H2O 2存在下，辣根过氧化物酶将HPA氧化成氧化二聚体(荧光物质)。在350纳米激发光的作用下，HPA发出波长为450纳米的荧光，可以用荧光光度计进行测量。在碱性条件下，1.2HPA、H2O2HRP、荧光、氧二聚体、AMPPD、AMPPD被AP水解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其分解半衰期为2 30分钟，并发出波长为470纳米的持续光。其强度在15分钟达到峰值，并在15 60分钟内保持相对稳定。在360纳米激发光的作用下，4-甲基伞形酮发出448纳米的荧光，可以用荧光光度计测量。荧光，AP，1.44-MUP，4-MU，360nm激发光，H3PO4，2。直接化学发光剂的特点是不需要催化剂，只需要改变溶液的酸碱度等条件就可以发光。快速响应、低背景、高信噪比、发射和声发射浓度之间的线性关系。常用试剂：吖啶鎓(AE)、CO2光和3。电化学发光剂是指通过电极表面的电化学反应发光的物质。特点：反应发生在电极上；(2)电子供体：TPA (3)化学发光剂：三吡啶钌，返回，三吡啶钌的分子结构图，第二部分发光酶免疫分析(CLEIA)。首先，原理属于酶免疫分析之一。只有在最后一个酶促反应中使用的底物是发光剂，发光反应发出的光在特定的仪器上测量。根据酶促反应的底物不同，技术类型可分为：1。氟酶免疫分析技术2。化学发光酶免疫分析技术，可分为1。双抗体夹心法和双抗原夹心法。固体抗原竞争法：氟酶免疫分析技术反应示意图，洗涤弃去上清液，根据免疫反应方式，产品稳定，荧光强度强，通过测量荧光强度进行定量。化学发光酶免疫分析技术的原理框图，洗涤上清液，和，是用酶催化发光底物直接发光，并通过光强测量直接定量。电化学发光原理示意图，这个过程可以在电极表面反复产生许多光子来增强光信号，返回不稳定激发态、基态、电极。1.抗原抗体结合反应：将包被有抗体的乳胶粒子和待测样品加入反应杯中，孵育一定时间后，加入AP标记的抗体，孵育形成固相包被的抗体-抗原-酶标记的抗体复合物，技术要点2。分离技术将复合物转移到玻璃纤维上，并用缓冲溶液洗涤。洗脱未结合的抗原，酶标记的抗体-抗原-胶乳微粒抗体复合物保留在纤维膜上。在酶促发光反应中加入4-MUP，酶标记抗体上的AP将4-MUP分解成4-MU，在360纳米激发光的照射下，4-MU发出448纳米荧光。荧光由荧光计记录和放大，被测物质的含量由计算机根据标准曲线计算。1.磁性颗粒分离法：磁性颗粒包被有抗原或抗体，磁性颗粒与样品中相应的抗原或抗体和酶标抗体或抗原经过一定的免疫反应后，最终通过磁场与结合的酶标集成电路和游离酶标分离。分离技术，2。微粒捕获法：所用微粒为非磁性微粒，作为抗体或抗原的包被载体，然后用纤维膜柱分离酶标记物的结合状态和游离状态。(3)包被珠子的分离：用抗原或抗体包被由聚苯乙烯和其他材料制成的珠子。抗原抗体反应后，结合状态和游离状态的酶标记被分离。第三节化学发光免疫分析技术(CLIA)。首先，化学发光试剂用于直接标记抗原或抗体，并与待测样品中相应的抗体或银、磁性颗粒银或抗体反应。通过磁场将化学发光标记的结合态(沉淀部分)和自由态分开，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过检测发光强度进行定量或定性检测。2，技术类型1。分离方法常用的磁性粒子分离技术2。免疫反应模式与酶发光免疫分析技术3相同。不同之处在于相应的标记是吖啶酯而不是酶。1.抗原抗体结合反应将包被有单克隆抗体的磁性颗粒和待测样品加入反应管。将样品中的待测银与磁珠上的Ab结合，并添加声发射标记Ab。孵育后，形成磁珠Ab-银-声发射标记Ab复合物。在电磁场中洗涤2-3次后，分离技术快速洗去未结合的过量银和标签Ab。3.在化学发光反应中，向洗涤过的磁珠中加入过氧化氢和酸碱度校正溶液氢氧化钠。此时，在没有催化剂的情况下，声发射会分解并发光。声发射被光收集器接收，并被光电倍增管放大，以记录1S内产生的光子能量。它的积分与被测物质的含量成正比。根据标准曲线，仪器可以计算出被测物质的含量。1.声发射背景噪声低，化学反应简单快速，无催化剂。方法评估，2。声发射和大分子的结合并没有减少光的产生量，因此增加了灵敏度，灵敏度可以降低ab用化学发光钌三联吡啶Ru(bpy)32标记，待测银或Ab根据钌三联吡啶在电极上发出的光强度通过银-Ab反应和磁珠分离技术进行定量/测定。技术类型1。分离方法中常用的磁粉分离技术2。免疫反应模式和酶发光免疫分析技术。相应的标签是三吡啶钌，而不是酶。1.将三吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体同时加入反应杯中，与待测样品进行孵育反应。技术要点2。将链霉菌抗生物素蛋白(SA)包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素(B)与抗生物素蛋白(A)结合，使磁珠与抗体结合，形成双抗体夹心法。蠕动泵将形成的Ru(bpy)32 -Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠复合物吸入流量测量室，磁珠被工作电极下方的磁体吸附在电极表面。同时，游离Ab也被吸出测量室。4.蠕动泵添加TPA，电极施加电压以启动ECL反应过程。这个过程在电极表面重复，产生许多光子。光电倍增管检测光强，光强与Ru(bpy)32的浓度成线性关系，因此可以测量待测银的含量。示意图，返回，抗体包被样品Ru(byp)2 TPA缓冲磁珠抗原标记抗体液洗涤，3，方法评价，1)标记回收，使发光时间更长，强度更高，易于测量；灵敏度