大肠菌群三步法与两步法的比较.ppt

大肠菌群的经典三阶段法和LST两阶段法的比较与评价，第一组，PPT制作：成都中医药大学PPT演讲： 试验菌种，培养基培养，稀释，混合待机，空白对照和多个平行，样品调制，检测过程，样品，三阶段，二阶段，乳糖发酵，平板分离，实证试验，初发酵，再发酵，MPN检索样品中的总大肠菌群MPN值，统计学方法计算，试验在不同模拟污染水平人工添加的革兰氏阴性无芽胞杆菌，能在37下分解乳糖产酸气体，氧和厌氧。 该菌群细菌可能包括大肠杆菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯菌、阴沟肠杆菌等。 不是代表某种细菌或某种细菌，而是指具有某种特性的与粪便污染相关的细菌组。 通过该菌群的检测状况显示食品中有无粪便污染。 大肠菌群数的高低显示粪便污染的程度，也反映了人体健康损害的大小。 广泛应用于食品卫生工作，样品的制备，1 .试验样品的种类和数量为模拟大肠菌群不同的样品生长环境，样品组成不同，选择种类不同的样品、水、食物、化妆品等，食品样品为肉类、乳制品、水产品、淀粉选择适当的种类数和数量，在处理前检查是否有大肠菌群和干扰菌，或进行高压蒸汽灭菌。 2 .空白试验在分析工作中，存在试剂和水中含有的杂质引起的误差等系统误差，为了消除这一部分的影响，提高分析精度，进行空白试验。 样品制备，3 .菌株将大肠菌群标准菌株(包括大肠菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、柠檬酸杆菌)在培养基上在35下培养混合24小时。 4 .为了菌落计数而灭菌的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液比生理盐水(NS )更合适。 PBS一边稀释一边保护菌体，调节pH，因为有市售品，所以NS是纯稀释液。 )用10倍系列稀释到10-10，然后用后4个稀释度*用营养琼脂计数。 各浓度在溶解温度46的15mL左右的营养琼脂培养基中加入1mL使其均匀凝固，在35下培养24小时，进行菌落计数。 (*赵贵明，边凌淳，用不同方法对食品中大肠菌群的结果进行比较，微生物学杂志，2003年11月第23卷第6期)，样品调制，菌落计数流程图，1 .选择平均菌落数在30300之间的进行计算，稀释度的平均菌落数属于该范围2 .两种稀释度均在30300之间时，国家标准方法应按两者的比例决定。 比率在2以下取平均，比率大于2时取小数字。 3 .所有稀释度都不在计数区间的情况。 均超过300时，将最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 均不到30的话，将最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 如果菌落数都不在30300之间，就必须将最近的300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 报告所有稀释度如无菌落生长，则无检出。 样品、样品的制备、5 .样品的制备按样品种类规定加入磷酸缓冲液进行处理，每个样品以高、中、低三个水平人工添加菌悬浊液，高度污染为600-1200CFU/g，中度污染为120-600CFU/g，低度污染同时使用相同的样品进行了3个平行试验和1个空白试验。 均质化后，在-18下预保存，试验前用无菌磷酸缓冲液稀释为10-3。检查方法：三步法和两步法，三步法：酸发生剂的发酵管在伊红美青琼脂平板上培养，可疑菌落的染色，镜子检查，实证试验，乳糖发酵试验，分离培养，实证试验，二步法： 接种月桂基硫酸盐氪(LST )肉汁培养，从产气剂LST肉汁管中取出培养物，移植到煌绿乳糖胆盐肉汁(BGLB )管中培养，初发酵试验、再发酵试验， 三阶段法使用的培养基及其作用乳糖胨培养液胨提供碳源和氮源满足细菌生长需要的牛肉膏提供碳源乳糖大肠菌群能分解的糖类氯化钠能维持平衡的渗透压勒紫乙醇溶液酸指示剂蒸馏水溶剂伊红美青培养基胨满足提供碳源和氮的细菌生长需要的乳糖大肠菌群能分解的糖类磷酸氢二钾中和过剩酸琼脂培养基固化剂蒸馏水 剂伊红水溶液大肠菌群特异性指示剂美青水溶液大肠菌群特异性指示剂，两步法中使用的培养基及其作用月桂基硫酸盐胰蛋白酶(LST ) 肉汁氪、氪提供碳源和氮源，满足细菌生长的氯化钠能维持平衡的渗透压乳糖大肠菌群发酵的糖类磷酸氢二钾(k2hpo4)缓冲剂磷酸二氢钾(缓冲剂月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群细菌生长的蒸馏水 溶剂煌绿乳糖胆盐(BGLB )肉汁胨碳源和氮源提供了满足细菌生长需求的乳糖 大肠菌群可发酵的糖类牛胆粉(oxgall或oxbile )溶液抑制非肠杆菌科细菌的0.1%煌绿水溶液抑制非肠杆菌科细菌的蒸馏水溶剂，能在两阶段法使用的培养基中添加指示剂吗？ 在LST中，大肠菌群分解乳糖产酸气体发生剂，用指示剂一般使用酸碱指示剂的话，LST培养基中有十二烷基硫酸钠(SDS十二烷基硫酸钠)，那是阴离子表面活性剂，水溶液为碱性，为了使大肠菌群生长，培养基中有磷酸缓冲在BGLB中，BGLB中的煌绿本身是指示剂，在培养基上呈绿色，其指示范围为0.0 (黄)2.6 (绿)，在一般的培养过程中是绿色，不典型。 但是，培养的酸过度变成黄色的情况也不少，所以如果加入指示剂的话，有可能妨碍现象观察。 另外大肠菌群分解乳糖产酸气发生剂，只要有气泡就能判断，所以无需添加指示剂。 月桂基硫酸盐胰蛋白酶(LST )、煌绿乳糖胆盐(BGLB )肉汁两种培养基对乳糖胆盐胨水有什么特别特征？LST、BGLB、乳糖胨培养基的不同，1 .氮源不同BGLB和乳糖胨培养基的氮源是胨、 (胰蛋白酶，又称胰蛋白酶、消化酶消化酪蛋白，是优质的胨，用胰酶消化新鲜牛肉和牛骨，浓缩干燥而成的淡黄色粉末。 )主要的差异是，胰蛋白酶处理后，很多大分子蛋白质的分子量变小，细菌更容易利用。 价格比蛋白质高。LST、BGLB、内酯培养基的差异，2 .培养基中的抑制剂的差异LST培养基中的月桂基硫酸钠(SDS )、阴离子表面活性剂，具有表面活性作用，有利于革兰氏阴性菌活性的提高和菌体分散作用的提高，具有更好的分离效果。 所以，作为鉴别的培养基。 BGLB中的煌绿是抗菌剂，主要抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌。 本培养基抗菌作用很强，能排除假阳性结果，常用于实证试验。 因为乳糖胨培养基中没有添加抑制剂，所以需要在曙红培养基中进行特异性的鉴别。 三阶段流程图、样品、稀释、乳胨培养基、361、24h2h、不产气、大肠菌群阴性、产气、伊红美兰琼脂平板、报告、361、18h-24h、革兰氏染色、乳胨培养基、革兰氏阳性、革兰氏阴性芽孢杆菌有报道称，24h2h、大肠菌群阴性、乳糖蛋白培养基中大肠菌群的生长现象、大肠菌群分解乳糖蛋白培养基的产酸剂。 溴甲酚紫是pH指示剂，酸性为黄色，碱性为紫色。 大肠菌群发酵后呈黄色，空白对照呈紫色。 大肠菌群发酵后，产气在逆管内有气泡。 空白对照没有气泡。 伊红美青培地上大肠菌群的菌落现象是，大肠菌分解乳糖酸时，细菌带有正电荷而被染红，与美蓝结合形成紫黑色的菌落，带有绿色的金属光泽。 样品： 25g (或25ml )样品225ml稀释液、均质、10倍系列稀释、适合连续稀释度的样品均匀液，接种LST肉汁管，361、48h、不产气、产气、BGLB肉汁、361下大肠菌群报告了两阶段流程图，48h2h，大肠菌群在LST培养基中出现现象，大肠菌群在LST培养基中产生气体，管内有气泡。 大肠菌群在BGLB培养基中生长，大肠菌群分解乳糖产酸气发生剂，阳性的结果是，反管内有气泡。 酸的产生过多的话，因为存在有指示剂的光辉的绿色(指示范围pH0.0黄-2.6绿)，所以从绿变为黄(右)。 结果计数，前提：空白对照没有大肠菌群检测，证明实验没有系统误差的干扰，结果的正确性得到保证。 用三段法和二段法计算最终确认的大肠菌群的阳性管数，检索国标中的MPN表，统计了每个样品的MPN数。 调查了样品调制时加入的不同梯度(高、中、低)的菌落形成单位和MPN表，调查了实际添加的菌落形成单位是否在MPN表的95%的置信区间内。 两种方法统计了范围外、阴性管数和阳性管数。 将MPN表、MPN(MostProbableNumber):的最大可能数、统计方法评价、统计结果汇总为四个表，对检查结果进行卡方检验，属性、合计、分组、三步法、两步法、落入95%置信区间的阳性样本数， 落在95%置信区间外的阳性样本数和阴性样本数，a(T11 )，c(T21) b(T12 )，d(T22 )，n1=a b，n2=c d，合计，m1=a c，m2=b d，n=abc，统计学方法评价，假设H0:1=2， 两种方法的检测率相同的H1:12两种方法的检测率不同，=0.05，各晶格理论度数tijt 11=n1 m