第21章-分子生物学常用技术.ppt

第二十一章,分子生物学常用技术ThePopularTechnologyinMolecularBiology,6/15/2020,1,第2节PCR技术,第3节转基因技术与基因剔除技术,第1节分子印迹与杂交技术,第6节蛋白质与核酸相互作用研究技术,第4节生物芯片技术,第5节蛋白质相互作用研究技术,6/15/2020,2,第一节分子印迹与杂交技术MolecularBlotting&HybridizationTechnology,6/15/2020,3,一、核酸分子印迹与杂交技术,指具有一定互补序列，不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的过程。,核酸分子杂交(nucleicacidhybridization),印迹(blotting),指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。,6/15/2020,4,学习要求1,(heteroduplex),6/15/2020,5,探针(probe),探针种类,标记物,指可用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的,与被测序列互补并经过特殊标记的DNA或RNA片段。,寡核苷酸基因组DNAcDNA片段RNA片段,放射性同位素,地高辛生物素荧光染料,r-32PATP,a-32PdATP,6/15/2020,6,H,dATP,*,*,6/15/2020,7,dUTP,Dig-dUTP,Biotin-dUTP,非放射性标记物,Dig-DNA探针杂交化学发光信号检测原理,Luminol化学发光原理,Biotin-DNA探针杂交化学发光信号检测原理,Luminol化学发光原理,Biotin,Avidin,（一）Southern印迹杂交,Southern印迹杂交（Southernblotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。,基本过程:,将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性，再将凝胶中的DNA分子转移到硝基纤维膜等固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。,可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。,6/15/2020,10,Southern印迹杂交的基本步骤:,待测DNA样品的限制性内切酶消化,酶切DNA样品的电泳分离,凝胶中DNA的变性和Southern印迹,探针的制备,Southern杂交,杂交结果的检测,6/15/2020,11,转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,NC膜或尼龙膜,（二）Northern印迹杂交,利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northernblotting）。,原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。,6/15/2020,13,Northern与Southernblotting的异同点,6/15/2020,14,HRP/AP标记抗体与Dig结合,漂洗和封闭,底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光,底物,电泳,转膜，紫外交联固定,North-South杂交原理和操作流程(地高辛标记),杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合,6/15/2020,15,North-South杂交原理和操作流程(Biotin标记),杂交：生物素标记探针与靶DNA结合,底物在HRP催化下,反应发光,电泳,转膜，紫外交联固定,HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合,6/15/2020,16,漂洗和封闭,1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5分钟；,2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。,后继的化学发光检测,Luminol化学发光原理,6/15/2020,17,（三）其他核酸杂交方法,1.斑点印迹杂交,2.原位杂交（insituhybridization）,将变性的DNA或RNA直接点样于NC膜或尼龙膜上，故称为斑点印迹。简便、快速，可以在同一张膜上进行多个样品的检测。,是指直接用组织切片或细胞涂片进行杂交的方法，可用于检测组织切片或细胞内某些特异性核苷酸或核酸片段。,6/15/2020,18,二、蛋白质印迹技术(Westernblotting),根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。因此，被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。,用Westernblotting检测样品中存在特异蛋白质用于细胞中特异蛋白质的定量分析用于蛋白质分子的相互作用研究,6/15/2020,19,6/15/2020,20,HRP/AP标记抗体与蛋白结合,漂洗和封闭,底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光,底物,电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上,1.WesternBlotting直接法操作流程:,6/15/2020,21,优点：,1.快速（一种抗体）,2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带,缺点：,1.免疫反应性较低,2.无信号二级放大,3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,6/15/2020,22,HRP/AP标记二抗与一抗蛋白复合物结合,漂洗和封闭,Y,底物与二抗-HRP/AP反应,显色或发光,底物,电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上,一抗与蛋白结合(小鼠单抗或兔多抗),2.WesternBlotting间接法操作流程:,6/15/2020,23,缺点：,1.较慢速（2种抗体）,2.有二抗交叉反应引起的非特异性条带,优点：,1.免疫反应性较高,2.有信号二级放大，灵敏度高,3.可选用的标记二抗体商品多,使用方便,6/15/2020,24,三种印迹技术的比较,SouthernblottingNorthernblottingWesternblotting,样品,限制性内切酶消化,电泳,变性,转移膜,紫外交联仪等固定,杂交标记物,DNA,RNA,蛋白质,需要不需要不需要,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE电泳,碱变性,甲醛或戊二醛变性,高温变性,NC膜或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,NC膜或PVDF膜,需要需要不需要,标记探针标记探针(标记)抗体,6/15/2020,25,第二节,PCR技术的原理与应用PolymeraseChainReaction,6/15/2020,26,5,Primer1,5,Primer2,5,5,TemplateDNA,一、PCR技术的基本原理,6/15/2020,27,6/15/2020,28,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)dNTPsMg2+,PCR体系基本组成成分,6/15/2020,29,一、PCR技术的基本原理,PCR反应循环,变性95C左右,延伸酶最适温度72,退火Tm-5C55,经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n,x=75%,n为循环数.,二、PCR技术的主要特点,1.特异性强,2.灵敏度高,3.简便快速,4.对标本的纯度要求低,6/15/2020,31,6/15/2020,32,（三）基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,（四）DNA和RNA的微量分析,（五）DNA序列测定,学习要求2,（二）基因的体外定点突变-PCR定点诱变,三、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的扩增与克隆,2.利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。,3.利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。,4.利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。,1.与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。,6/15/2020,33,（一）目的基因的扩增与克隆,（二）基因的体外定点突变-PCR定点诱变,TheNobelPrizeinChemistry1993,forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry,MichaelSmith,1944-,1932-2000,LaJolla,CA,USA,KaryB.Mullis,UniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method,forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies,6/15/2020,35,电泳,（五）末端合成终止法测定DNA序列的原理,*2，3双脱氧核苷酸,*用4种不同荧光标记,DNA样品、引物DNA聚合酶、dNTP,A,A,C,G,T,G,G,A,C,T,DNA自动测序结果,6/15/2020,37,TheNobelPrizeinChemistry1980,forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA,fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids,PaulBerg,1/2oftheprize,StanfordUniversityStanford,CA,USA,1926-,WalterGilbertFrederickSanger,1/4oftheprize1/4oftheprize,HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USA,MRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom,1932-,1918-,弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。,（二）原位PCR技术(insituPCR),（三）实时PCR技术(real-timePCR),通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。,6/15/2020,39,（一）反转录PCR技术(RT-PCR),四、几种重要的PCR衍生技术,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法,实时荧光定量PCR,PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号；每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,6/15/2020,40,第三节转基因技术与基因剔除技术TransgenicTechnology&GeneKnockoutTechnology,6/15/2020,41,是指将外源基因整合到动物或植物细胞的基因组中，并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定地遗传和表达的技术。,基因的导入方式主要：显微注射法(最常用)胚胎干细胞法逆转录病毒感染法,6/15/2020,42,一、转基因技术,基本原理是采用显微注射等方法，将目的基因导入受精卵或着床前的胚胎干细胞核内，并经同源重组整合到的基因组DNA中，然后将细胞置入受体动物子宫，使之发育成个体。,转基因(transgene)：被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)：目的基因的受体动物,乳腺生物反应器的诞生,据推测，2010年世界上采用动物乳腺生物反应器生产的年产超过了500亿美元。,1987年Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清蛋白基因的启动子构成重组基因，培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠。,是用显微操作、电融合等方法，将供体动物体细胞的胞核，全部导入另一动物个体的去核卵细胞中，然后将其置入受体动物子宫，使之发育成为动物个体的技术员。,6/15/2020,46,二、核转移技术-即体细胞克隆技术,核转移技术产生的个体所携带的遗传物质，与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖过程，即克隆(clone)。,1997年2月27日Nature杂志报道：科学家维尔穆特(Wilmut)和坎贝尔(Campbell)，利用克隆技术，培育出一只小母羊“多利”。克隆技术被科学评为1997年世界十大科技进步之首。“多利”诞生标志着生物技术新时代的来临,1.用于动物克隆转移的核末经修饰,核转移技术的基本原理,1.将供者细胞核注入到去核卵细胞内,2.用电转移法将供者细胞核注射到去核卵细胞内,1997年6月维尔穆特(Wilmut)报道：用基因改造过的胎儿成纤维细胞为核供体，获得了表达人凝血因子IX的转基因克隆绵羊“波莉”。,克隆出携带有人凝血因子X基因的绵羊早期胚胎成纤维细胞。,以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经过处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。,获得3只能高水平表达人凝血因子X（125g/ml）的绵羊。,2.用于转基因动物生物反应器的制备转移经过修饰的核,又称基因打靶(genetargeting),原理：,通过DNA定点同源重组，使动物胚胎干细胞(ES细胞)的某特定内源基因被破坏而造成其功能丧失。,6/15/2020,50,三、基因剔除技术(geneknock-out),是采用分子生物学的方法，定向敲除动物体细胞内的某个基因的技术。,基本过程包括：,用同源基因片段构建含有失活目的基因的载体；,显微注射法将含有失活目的基因的载体导入ES细胞，与ES细胞染色体的相应基因发生同源重组，替代(剔除)掉ES细胞中原有的正常/异常基因；,将含有基因剔除的ES细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫中，使之发育成一种既含基因剔除细胞又含正常细胞的嵌合体小鼠；,将嵌合体小鼠与正常小鼠交配，最终筛选出基因剔除的纯合子小鼠。,将剔除正常基因的ES细胞注入动物的囊胚中，使其与囊胚中的细胞共同组成囊胚内的细胞团；,四、基因转移和基因剔除在医学中的应用,（一）建立疾病动物模型,（二）生物制药,（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的动物器官,6/15/2020,52,建立人类疾病的各种动物模型，研究基因在动物体内的表达调控规律及其产物与疾病的关系。,转基因动植物作为医用或食用蛋白的生物反应器，用于生产出具有医药价值的多肽或蛋白质、抗体、疫苗等。,学习要求4,第四节生物芯片技术BiochipTechnology,6/15/2020,53,生物芯片:,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。,6/15/2020,54,是指采用微电子和微加工技术，将大量已知序列的核酸或蛋白质片段等，有序地组合在约1cm2大小的固相介质表面而构成的集成分析系统。,将其与标记样品中的特异核酸或蛋白分子杂交、结合，通过对“标记”的测定即可实现对核酸或蛋白质组分的快速、高效的分析处理。,DNA芯片(DNAchip)、DNA阵列(DNAarray)或cDNA芯片(cDNAchip),一、基因芯片(genechip),6/15/2020,55,指以原位合成或显微打印的方式，将大量特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列、固化在约1cm2的支持物上。,使用时与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析从而得出样品的遗传信息。,6/15/2020,56,玻片型这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，1040万点阵/cm2，必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。(Affimetrix公司)。,2202芯片点样仪,*Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组。,*红色表示上调；黄色表示不变；绿色表示下调。,是将蛋白分子作为探针，高度密集排列、固定在固相支持物上的点阵。加入待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片(proteinchip),6/15/2020,59,基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。最常用的探针：抗体检测方法：标记检测法、直接检测法,又称蛋白质阵列(proteinarray),学习要求5,第五节蛋白质相互作用研究技术Protein-ProteinInteractionTechnology,6/15/2020,60,该系统的建立是基于对酵母转录因子GAL4分子的研究。,GAL4,（一）基本原理,一、酵母双杂交系统,（yeasttwo-hybridsystem）,6/15/2020,61,BD能识别位于Gal4效应基因的上游激活序列(UAS)；,GAL4的DNA-BD和DNA-AD结构域：,6/15/2020,62,AD可与其他成分结合而启动UAS下游的基因转录。,BD和AD两结构域单独存在时无转录激活功能；,只有两者连接而形成的空间结构才具有转录激活功能。,6/15/2020,63,将BD基因与已知蛋白基因X融合后，插入表达载体中构建BD-X重组载体；,将AD基因与未知蛋白群基因Y(或未知蛋白群cDNA文库)融合后，插入表达载体构建AD-Y重组载体群。,宿主菌:剔除了转录因子GAL4；在其GAL4基因启动激活序列的下游插入特定的报告基因，如-半乳糖苷酶编码基因，表达产物为-半乳糖苷酶。,转录因子激活序列(UAS),Y=Y1,Y2,Y3,.,Yn,（二）酵母双杂交系统的应用,1.分析已知蛋白质之间的相互作用,2.筛选和发现新的相关蛋白质,3.筛选药物的作用位点及药物对蛋白质之间相互作用的影响,4.绘制蛋白相互作用系统图谱,6/15/2020,65,二、噬菌体展示技术,是将外源蛋白或多肽，与噬菌体表面蛋白融合表达，并呈现在噬菌体表面的技术。,通过与特定的标记抗体(或受体、配基等)结合，可把展示有特定蛋白的噬菌体，从表达有各种外源性蛋白的噬菌体肽库中筛选出来；,感染大肠杆菌扩增选出的噬菌体，分离出融合基因并测序，可获得相应的结构与功能的信息。,三、蛋白质工程中的定点诱变技术,是在编码蛋白质基因的特定位置引入碱基替代、产生碱基缺失或插入，使其编码的蛋白质的一级结构发生改变。,在合成PCR引物时，除了在定点诱变的位置引入相应的突变（点突变、小片段插入或缺失）外，其余序列与模板完全配对,PCR扩增后，产物中就引入特定的突变；将PCR产物克隆表达，可获得定点突变的蛋白质。,PCR诱变：,6/15/2020,67,学习要求6,第六节蛋白质与核酸相互作用研究技术Protein-NucleicAcidInteractionTechnology,6/15/2020,68,一、电泳迁移率变动分析,（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）,又称凝胶阻滞分析(gelretardationassay),与游离D