小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备【目的要求】1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点【基本原理】在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。【实验用品】1器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等；2试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoys固定液（甲醇：冰醋酸3：1）、0.075 mol / L KCI溶液、Giemsa染液等。 3材料：65-90天健康小鼠（生技09级72人，新华09生物技术36人，生科08级75人，生技08级70人，共253人，需购小鼠110只）【方法与步骤】1前处理 取材前34 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射26g，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g的蟾蜍，若按4g / g注射，需注射浓度为0.1 的秋水仙素溶液0.2 ml ）。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。 2取骨髓细胞 处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心510 min，弃去上清液。3低渗 根据骨髓细胞液的多少，加0.075 mol / L的 KCI液56 ml，在37水浴箱中或室温下低渗2030 min。低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。4预固定 低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷Carnoys固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。然后以1000 r / min 离心8 min。5固定 弃去上清液，加56 ml Carnoys液，轻轻吹打细胞，静置固定20 min。离心弃去上清液，再加56 ml Carnoys液，固定20 min。 6制备细胞悬液 离心弃去上清液，再加少许新鲜Carnoys固定液，用吸管将固定后的细胞吹散，并反复吹打混匀，制成浓集的细胞悬浊液。 7准备载玻片 滴片前12 h，将洁净的载玻片放在04冰水中，使其表面附有一层水膜。这样在滴片时，细胞悬液遇到载玻片上的冷水，染色体会迅速分散开来。 滴片法制备染色体标本8滴片 取出预冷的载玻片，将其倾斜约30放置。吸取细胞悬液，从距离载玻片40 cm 以上高度处滴至载玻片上23滴；滴片后立即用嘴或洗耳球对准滴片处轻微吹气；也可用镊子夹住载玻片、在酒精灯火焰上迅速过几下（见图），这样都有助于染色体分散和展开。9干燥 使滴片在室温下自然干燥，或在酒精灯火焰上烤干，也可用吹风机冷风吹干。 10染色 待滴片充分干燥后，用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释的Giemsa染液（Giemsa原液：缓冲液1：10）染色30 min。然后自来水冲洗，空气干燥。镜检。【结果观察】1.在低倍镜下观察Giemsa染色后的中期分裂相形态。2.选择分散适度不重叠染色体的分裂相，在高倍镜下进行观察。3.观察小鼠染色体的端着丝粒的特征，识别着丝粒，染色单体，染色体，计算染色体数目，寻找雌雄小鼠之间在核型上的差别。【作业】交一张已染色的骨髓细胞染色体标本片，绘制图。滩母羊促卵泡素受体FSHR基因PCR-RFLP分析【实验目的】1熟悉PCRRFLP分析技术原理及实验步骤。2掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。3了解PCRRFLP在遗传病基因诊断中的作用。【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温(约93-95)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温(约50-70)下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70-75）下沿模板按53方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n倍,一般PCR经30-40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。 聚合酶链式反应限制性片段长度多态（PCR-RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 本实验以滩母羊外周血DNA为模板，PCR扩增促卵泡素受体FSHR基因的306bp特异片段产物，其中包含AluRFLP多态位点，经Alu酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度（243bp或193bp+50bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断滩母羊是否得到了带有缺陷F基因的染色体，从而做出间接基因诊断。【实验用品】1DNA（50ng/l）、引物和（20）、TaqDNA聚合酶（5U/l）、10PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶Alu（20U/l）、10酶切缓冲液。07级共134人，共需要TaqDNA聚合酶（250U）、dNTP（1ml）、限制性内切酶Alu250U三支试剂。22%的琼脂糖凝胶、5TAE、6上样缓冲液、DNA Marker、Goldview染料。3PCR仪、凝胶成像系统、微量加样器（5l、20l、200l）、枪头（20l、200l）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。【实验步骤】一PCR反应PCR反应体系20l，其成分如下：按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.5ml离心管中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。PCR 反应循环温度：94预变性3分钟，然后进行以下循环30次最后经72再充分延伸7分钟。反应结束后置4冰箱保存。二PCR产物的Alu酶切反应体系15l其成分如下：PCR产物 6lAlu（10U/l） 1l无菌水 8l置37水浴消化1小时，4保存。三琼脂糖凝胶电泳检测1胶板的准备取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.51.0ml的位置放入梳子。22%的琼脂糖凝胶的制备称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65左右，加入2.5l溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5g/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。3将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电