PCR技术的原理及其应用

PCR技术的原理及其应用，PCR技术的简单历史，最早，Korana在1971年提出核酸体外扩增的构想。 “经过DNA改性，与合适的引物进行杂交，用DNA聚合酶延长引物，可以重复这个过程克隆tRNA基因”。 1985年美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室的Mullis等人发明了聚合酶连锁反应。 其原理类似于DNA的体内复制，但为试管中DNA的体外合成提供了适当的条件模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、适当的缓冲系统、DNA变性、恢复性和拉伸的温度和时间。 1988年Saiki等人从从温泉分离的水生好热杆菌(thermusaquaticus )中提取了耐热性的DNA聚合酶。 该酶耐高温，提高了扩增片段的特异性和扩增效率，增加了扩增长(2.0Kb )。 由于放大的特异性和效率提高，其灵敏度也大幅度提高。 该酶的发现广泛应用了PCR技术。 1、PCR技术的基本原理，PCR由改性退火拉伸三个基本反应步骤组成：模板DNA的改性：在高温(93左右)下，扩增的目标DNA双链热变性成为双链DNA模板模板DNA和普拉：在低温(3755)下，人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA的单链互补序列成对结合的引物的拉伸：在TaqDNA聚合酶的最佳温度(72)下，以dNTP为原料，以碱基对和半保留复制原理从引物的53方向重复循环变性：退火：延长三个过程可以获得更多的“半保持复制链”，这个新链将成为下一个循环的模板。 PCR反应的五要素：参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板和Mg2。 引物：引物是PCR特异性反应的关键点，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 理论上，如果知道模板DNA的序列，可以设计互补的寡核苷酸链作为引物，可以利用PCR在体外大量扩增模板DNA。 酶浓度：催化PCR反应需要约1ul的酶量(总反应体系为100ul时)，浓度过高可能引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量和浓度：注意4种dNTP的浓度相等(等摩尔调制)。 其中一种浓度与其他种类不同时，引起失配的浓度过低会降低PCR产物的产量。 dNTP与mg-2结合，降低游离的mg-2浓度。 模板：模板核酸的量和纯化程度是PCR成败的重要环节之一。 传统的DNA纯化方法通常用SDS和蛋白酶k消化处理标本。 SDS的主要功能是，溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，溶解膜蛋白，破坏细胞膜，解离细胞中的核蛋白，SDS也能与蛋白质结合沉淀的蛋白酶k水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，有机溶剂菲提取的核酸可以作为模板用于PCR反应。 一般的临床检查标本，可以用快速简便的方法溶解细胞，分解病原体，消化去除染色体的蛋白质，游离靶基因，直接用于PCR扩增。 RNA模板的提取一般采用异硫氰酸酯胍和蛋白酶k法，防止RNase分解RNA。 Mg2浓度： Mg2对PCR扩增的特异性和产量有显着影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2浓度以1.52.0mmol/L为好。 Mg2浓度过高时，反应特异性降低，出现非特异性扩增，过低时，TaqDNA聚合酶的活性降低，反应生成物减少。 2、PCR技术的主要类型及其应用，原位PCR技术：原位PCR通过在组织细胞中进行PCR反应，结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高特异性PCR技术的优点，是细胞学科学研究和临床诊断领域有很大潜力的新技术insituPCR可以识别具有靶序列的细胞，显示靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制、临床过程和病理转移具有重要的实用价值。 其特异性和敏感性高于一般的PCR。 逆PCR :逆PCR的目的是放大已知序列旁的DNA，即该反应体系在引物外合成DNA，而不是在一对引物之间，研究导致已知DNA片段的未知染色体序列。 此时选择的引物与核DNA区的两末端序列互补，但两引物3端相互反向。 放大前用限制酶酶切断样品DNA，用DNA连接酶与环状DNA分子结合，用逆PCR放大引物上游和下游的片段。 利用逆PCR放大未知序列后进行分析，搜索与已知DNA片段相邻的序列，分子克隆只知道部分序列的全长cDNA，可以制作全长DNA探针。 适用于基因迁移、重排因子和已知序列DNA的边病毒整合部位的分析等研究。 逆PCR的原理图、逆PCR的不足：需要从多种酶中选择限制酶，或者选择适当的酶切酶得到合理大小的DNA片段。 这种选择不能在非酶切位点切断目标DNA多数有核基因组含有中等和高度的重复序列，但YAC和Cosmid中的未知功能序列也有这些序列，逆PCR得到的探针可能与多个基因序列杂交。 锚点PCR :锚点PCR (锚点PCR，A-PCR )主要用于分析具有可变末端的DNA序列，Loh等人用锚点PCR分析人外周血淋巴细胞t细胞受体链的mRNA的多变性。 合成cDNA，利用末端脱氧核苷酸转移酶，在其3可变区域的末端附加PolyG尾。 Loh等人在一定区和可变区的连接部设置了引物，另一个引物是具有5polyg尾的引物。 带有PolyG尾巴的引物可以是固定点，与PolyG尾巴结合，利用不论剩馀部分的序列，只识别片段末端的方法，可以从上述的mRNA中检测至少20种不同的序列，各自独特，锚点PCR是什么特殊的固定PCR的原理图、标记PCR和彩色PCR :标记PCR(LabelledPrimers，LP PCR )、LP PCR使用同位素或荧光素标记PCR引物的5端，检测目标基因的存在。 彩色PCR (colorcomplementationassaypcr，CCAPCR )是LP-PCR的一种。 因为引物的5端用不同颜色的荧光染料标记，所以扩增的目标基因序列上附有引物5的染料，通过电泳和离心沉淀，用肉眼可以根据不同的荧光颜色判定目标序列的有无及其扩增状况，该方法可以通过基因的突变、染色体的重排、 非对称PCR :非对称PCR(asymmetricPCR )是等量的引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA。 一对引物分别称为非限制性引物和限制性引物，其比例一般为501001。 在PCR反应的最初1015个循环中，扩增产物主要是双链DNA，但如果限制引物(低浓度引物)被消耗，非限制引物(高浓度引物)诱导的PCR会产生大量的单链DNA。 非对称PCR的关键是控制受限引物的绝对量，需要多次探索优化两种引物的比率。 另一种方法是先用同浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA，然后以该双链DNA为模板，用其中的一条引物进行第二次PCR，制备单链DNA的方法。 用非对称PCR制作的单链DNA主要用于核酸序列的测定。 多重PCR :一般的PCR只是一对引物，通过PCR扩增产生核酸片段，主要用于单一病原因子等的鉴定。多重PCR(multiplexPCR )又称为多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系中加入2对以上引物，同时扩增多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 多重PCR的用途主要有2种：1.同时检测或鉴定多个病原微生物，在同一PCR反应管中同时加入多个病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。 可以用于同时检测多个病原体，或鉴定其类型的病原体感染。 2 .致病微生物，某些遗传病和癌基因的分型鉴定：某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，种类多，或突变或缺失存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率，同时鉴定其种类或突变等。 多重PCR的特征是高效率，在同一PCR反应管内同时检测多个病原微生物，或分类多种目的基因，特别是一滴血能检测多个病原体系统性、多重PCR，没有肝炎病毒、肠道病原性细菌、性病、芽胞厌氧菌， 适合同时检测战伤感染细菌和细菌战剂经济简便，在同一反应管内同时检测出多个病原体，大大节省时间，节约试剂，节约经费，为临床提供更准确的诊断信息。 免疫PCR :免疫-PCR(immuno-PCR )是一种新建立的灵敏特异的抗原检测系统。 利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏度来检测抗原，特别适合检测微量抗原。 免疫PCR试验的主要步骤为：抗原抗体反应，与嵌合连接分子结合，PCR扩增嵌合连接分子中的DNA (一般为质粒DNA )。 这个技术的重要环节是嵌合连接分子的制造。 在免疫PCR中，起到嵌合结合分子的桥的作用，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，