DB21∕T 2628-2016 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片

B 50/59  宁 省 地 方 标 准  26282016 鱼类物种鉴定  析法 of  016 - 05 - 09发布 2016 - 07 - 09实施辽宁省质量技术监督局   发 布   26282016 I 前  言 本标准按照 准化工作导则第一部分标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：大连出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。 本标准系首次发布的地方标准。  26282016 1 鱼类物种鉴定   范围 本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法 合基因芯片分析法的技术规范要求。 本标准适用于鱼体肌肉组织，鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。  27025   检测和校准实验室能力的通用要求  27403   实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 种 物种是生物分类学的基本单位，也是生物繁殖的基本单元。物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体，与其他相似群体在生殖上相互隔离，并在自然界占据一定的生态位。 制性片段长度多态性聚合酶链式反应 因芯片 基因芯片也叫核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对4 抽样与制样 将实验室样品粉碎，充分混匀后待用。 5 防污染措施  27403的规定 6 原理  26282016 2 酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种的个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。增目的 增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在基因芯片分析仪上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同， 产生不同程度的7 仪器设备 子天平：式离心机（最高转速15000g），台式小型离心机 温水浴锅（371、651） 涡振荡器 温冰箱（2、冷藏冷冻冰箱（ 光压灭菌锅 时荧光片电泳仪(2100生物分析仪)。 量可调移液器及配套吸头 8 主要试剂 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合 27025 的规定。 括 试剂盒内包括细胞色素制性内切酶、000芯片试剂盒； 他9 检测步骤 品预处理  26282016 3 剪取样品50 100 合均匀后捣碎后放入 1.5 待用。 因组用样品加入 20和200匀后65孵育10 14000 取上清液,按照后将鱼基因组)，于- 20保存。 可根据实际情况选择适宜的方法，对于一种动物可以提供几种常用的允许其他提取方法的使用，提取的标 个样品各做二个平行管。加样时应使样品要粘附于管壁上。在 25中包括模板 表1 析条件 期扩增片段大小约为 464 表2   1 95 5 5 30 0 30  40 72 30  1 72 7 ：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 制性内切酶酶切： 将 25L 种限制性内切酶混匀, 37 酶切 2 h,然后加入 1L 60 乙二胺四乙酸(混匀, 65 灭活内切酶 15   ,L 45L 2  26282016 4    室温下静置 30试剂盒说明将  2240 5 次在芯片相应孔中加入 951L  1酶切产物 )。在 密度试验 在重复条件下，获得多次试验结果的相对偏差即酶切数据大小不得超过产物大小的5%。 10 结果处理与分析 对于取的、谱分析和数据分析。图谱可以显示出不同的条带，数据分析显示出酶切数据大小，进而对鱼种进行区分。 11 结果判断与表述 制性内切酶酶切结果 样品、切片段与附录果表述 鱼种。  26282016 5 A  A  附 录 A （资料性附录） 酶切片段比对 鱼种名  酶 酶 真鳕 209   247 47   109   331 94   104  286 狭鳕 209   240  74   105   248 103  287 黑线鳕 450 45   435 98   189 马哈鱼 119   354 438 99   192 无须鳕 466 110  330 129  360 小黄鱼 441 126  336 88   98   286 花鲈 88    115  261 141  315 438 蓝点马鲅 213   226  127  146  183 121  159  180 鲐鱼 211   224 127  326 89   103  274 棘头梅童鱼 446 130  330 91   103  285 许氏平鮋 146   295 134  323 103  362 长蛇鲻 475 44   106  322 84   105  303 鲬鱼 162   279 144  289 98   190 日本下鱵鱼 123   349 149  189 94   107  289 长吻红舌鳎 145   324 131  330   448 斑纹条鳎 165   279 135  290  473 方式云鳚 122   266 148  326 146  283 太平洋绒杜父鱼 456 148  330 148  285 黄尾鰤 123   264 436  127  164  191 绿鳍马面鲀 123   295 180  232 151  319 大菱鲆 123   295 135  150  189 488 日本笠鳚 123   350 85   97   179 104  288 牙鲆 145   240 96   135 103  373 大泷六线鱼 454 92   150  238 103  376 斑尾复鰕虎鱼 487 107  322 94   122  164 石鲽 146  283 137  238 92   106  295 木叶鲽 189  243 134  159 91   107  206 粗壮拟庸鲽 146  267 137  294 93   106  290 黄盖鲽 122  332 108  127  192 125  350 亚洲箭齿鲽 96   148   217 133  344 108  378 星斑川鲽 187  277 135  293 92   105  289  26282016 6 鱼种名  酶 酶 马舌鲽 483 86   294 92   105 293 箭齿鲽鱼 96    148    216 133  342 108  378 平头鲽鱼 146   269  137  294 91   105  290 黄金鲽鱼 160   285  135  296 184  292 岩鲽 190   290 135  293 94   107  294 黄肚鲽鱼 145   305