冷冻保存同种异体血管研究进展

1/8冷冻保存同种异体血管研究进展随着现代免疫学、冷冻生物学、分子生物学的发展，冷冻保护剂、免疫抑制剂的应用以及注重移植结构及功能的完整。冷冻保存同种异体静脉无论是基础研究还是临床实践都获得相当经验，但存在移植物再狭窄及替代小口径动脉MM失败率高的缺点。近年来，有关动脉作为血管替代物逐渐被重视，取得一些进展，但尚需继续长期地探索和实践。1血管移植免疫进展大量的实验和临床结果不但证实血管内皮细胞EC是移植排斥重要的靶器官，而且通过其抗原递呈作用、表型变化和细胞因子合成等，主动参与移植排斥过程。EC表达多种抗原，如ABO血型抗原，MHC抗原和血管内皮细胞抗原系统。在排斥过程中，EC上的抗原与其相应的抗体结合形成抗原抗体复合物，激活补体释放趋化因子，白细胞在补体参与下溶解EC，使基底膜暴露，激活凝血系统，形成血栓，激活的巨噬细胞释放白介素1、肿瘤坏死因子等可提高EC表面组织因子活动，增加纤溶酶激活物抑制因子和减少血栓调理蛋白，EC在细胞因子刺激下可合成和分泌单核细胞趋化因子MCP1/JE，吸引单核巨噬细胞迁移至移植物局部。同时表达CLASS抗原，提供所有激活2/8CD4T细胞所必需的信号，并可产生各种细胞因子，引起表型的变化。另外内皮细胞膜还可作为血管紧张素转化酶场所，以使血管紧张素转化成血管紧张素，使血管收缩。近来，一些学者发现血管平滑肌细胞也表达CLASS和CLASS抗原系统，参与排斥反应全过程1。同种异体血管移植的基础研究进展1移植前血管处理及冷冻复温技术制备1供体选择来源于新鲜尸体及创伤性截肢患者，采用美国组织库协会AATB制定的标准2。取血管应在死后H完成，所有操作均在无菌条件下进行。2制备技术的基本原则从供体获取血管应严格遵循无创伤技术；获取血管前1530MIN，供体给予平滑肌松弛剂罂粟碱及抗凝药物肝素，以防止血管痉挛和血栓形成；保持制备液和室温37；灌注压100MG。3理论上以37自身含罂粟碱肝素化血液低压灌注可最好保持血管的生物活性，但通常从供体获取血液是困难的。目前常采用37的生物培养液如DMEM，1640，BROCDBANK等获得保存2H后80内皮细胞存活率和平滑肌收缩度最大限度的保持3。冷冻复温随着冷冻保护剂二甲基亚砜DMSO和甘油的应用及控温冷冻技术的成熟，血管活性得以很好的保持。DMSO因穿透力强，研究较多，其浓度以15为最佳。控温3/8冷冻第二步温值在6080之间，冷冻速率为1/MIN，复温采用37水浴快速复温。经过这样处理的静脉获得80的内皮细胞存活率。BANBANG等证实这些内皮细胞具有与正常内皮细胞相似的增值和抗凝血功能4。SALOMON等也从冷冻保存静脉上获得表达HLA抗原的平滑肌细胞1。2实验性同种异体移植与自体移植的比较性研究同种异体血管移植的主要障碍是受体的免疫排斥反应。因此，研究在免疫缺陷的情况下在体冷冻保存血管移植的变化是必需的。这样自体冷冻血管不仅检验血管制备及宿主对移植物产生排斥反应的冷冻保存技术的效果，而且通过与同种异体移植物移植后组织结构与功能的对比，了解同种异体移植物在整个过程中的变化。自体移植物在移植过程中，可因离体缺血、牵拉、切割、吻合及在受体动脉高压冲击下，内皮细胞可有不同程度的坏死，从而使位于内皮细胞下的结缔组织裸露于血流，使附壁血栓形成。1周后残留的附壁血栓向致密而平滑的纤维被膜演变，同时内皮细胞再生开始。内膜增生和动脉粥样硬化是发生在内皮下层两个相关联的病理现象，或许是不可避免的创伤适应性改变。移植血管中膜可见平滑肌细胞坏死和纤维替代，外膜因部分胶原纤维束断裂和血管滋养管栓塞，形成纤维瘢痕，移植后7H，新的滋养血4/8管出现，2个月后基本恢复正常，神经再生于24周后开始。上述这些改变实质上是导致自体静脉移植后失败的病理基础。相对于自体静脉移植的内膜增生，同种异体移植物动脉化主要是中膜增生5。当在同种异体移植物中又观察到的内膜增生是由于局部血栓沉积后成纤维细胞的重新排列，移植后10D内皮细胞因免疫反应而脱落，在随后的6个月内，裸露的内膜上纤维蛋白堆积减少并出现重新内皮化，36个月移植物外膜的血管周围组织可见游离淋巴细胞并在个月后消失。移植后5个月前列环素PGI2生成量与受体动脉PGI2生成量相比有显著性差异P6。新鲜静脉的顺应性明显低于正常动脉灌注压下动脉顺应性P5，可以看出，尽管移植段静脉结构发生动脉化，但其内膜功能和生物力学特性并未发生动脉化。自体移植物与异体移植物短期的不同在于异体移植物经历一个免疫反应及内皮细胞脱落的过程，因此，减少或阻止受体免疫排斥反应的实验被尝试。3免疫抑制剂对同种异体移植物的影响移植物免疫反应特点已见前述，可以肯定免疫排斥反应在移植过程中扮演极其重要的角色。AUGELLI分别用倒置异体静脉作为动脉桥接物，结果显示经免疫抑制剂处理组与未用免疫抑制剂处理组通畅率之比为7/110/10，有显著性差异5/8P，但长期通畅率依赖于免疫抑制剂的应用7。MILLER等移植术后受体行免疫抑制治疗及抗血小板治疗1月后，血管平滑肌丧失功能8。可以看出尽管免疫抑制剂可能增加移植物通畅率，并且不损害内皮细胞的可能性也存在，但免疫抑制剂增加血小板聚集及血栓素TXA2的释放，减少前列环素PGI2的产生，同时潜在的免疫抑制特性可能导致感染、神经、肾毒、肝脏、血液、内分泌等并发症9。因此，移植物的治疗代替受体的治疗能避免免疫抑制剂的并发症，这建立在冷冻保存移植物免疫抑制剂术前治疗可能会减低免疫反应和提高通畅率这个假设上，静脉移植物术前治疗能显著提高通畅率已作为一种方法被肯定。4血管移植受体的抗凝血治疗在药物实验中抗血小板治疗能减少移植物血栓形成的观点已被接受。动物实验证明，经抗血小板治疗的异体移植物与未经治疗移植物早期通畅率之比为835810。近年来，对阿司匹林等抗凝药物的作用机制有新的看法，认为其在抑制血小板释放效应的同时，也抑制血管内皮细胞PGI2的合成11。因此，抗凝药物使用与否，有待于进一步的对比研究和临床长期观察。临床应用的初步结果初期一些学者通过戊二醛、酒精浸泡、冷冻、射线6/8照射等来降低移植物的抗原性，以提高移植物的通畅率，这些研究结果从术后612个月15至1342个月78的不等通畅率。1971年D用改良的脐带静脉行下肢血管重建术后3年获得股股腓的通畅率。SHAN等列出了38个患者43条硫酸软骨素保存的静脉得到917个月至1218个月累积的通畅率。1994年MESTRES报道用大口径冷冻保存动脉得到8个月的通畅率12。另外，一些回顾性的随机的临床报告正着手调查，这些研究包括失败的机制以及猜测治疗干涉手段或改善移植术的外科技术，更多的临床经验和移植物的长期观察和积累，将决定是否在无合适的自体血管下有限制的使用问题。同种异体血管移植失败的影响因素影响移植段通畅率的因素，分为内源性和外源性两类，影响移植段远期通畅率的主要因素是内源性因素。外源性因素包括1手术技术缺陷未遵循无创伤原则，吻合技术所致吻合口狭窄、扭曲等；2流出道受阻MCNALLY报道在膝关节以下动脉旁路移植术后1年通畅率的结果，当移植物处于01个流出道情况下得到44的通畅率，而在23个流出道时则获得73的通畅率13；3静脉移植瓣膜；4其他如内毒素、感染等。内源性因素包括1免疫排斥反应；2管壁结构的病理性改变，如动脉粥样硬化；3生物力学的不匹配，如顺应性的改变；7/84移植段功能的改变，如PGI2的释放减少，TXA2的释放增加。另外，血管内膜释放的内皮细胞血管舒张因子EDRF、内皮素ET、抗凝血酶AT和肝素分子复合物、血栓调理蛋白TM、蛋白激酶CPC以及纤溶酶原激活物PA也参与整个过程14。近来一些生长因子，如血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子和转移生长因子的作用也得到重视15。这些物质如何相互作用，影响移植物通畅率，是今后值得进一步研究的课题。展望尽管冷冻小血管异体移植已经取得很大成绩，并展示出令人激动的前景，但仍有许多尚未解决的问题和难点，如移植段新生内皮细胞的来源，冷冻保存能否降低抗原性，冷冻保存动脉移植能否成为合适的移植物应用于