禽传染性支气管炎病毒一步法rt—pcr检测方法的建立及应用

1/5禽传染性支气管炎病毒一步法RTPCR检测方法的建立及应用禽传染性支气管炎病毒一步法RTPCR检测方法的建立及应用鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化等系统1，常给养鸡业带来巨大的经济损失。IBV是单股正链RNA病毒，一般对病毒的扩增都需要先将RNA反转录为CDNA然后再进行PCR扩增，本试验将RTPCR反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便，降低操作过程中的污染几率，目前已成为临床上检测和疾病诊断的一个重要发展方向2。1材料与方法病毒IBV、IBDV和NDV均由莱山区某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自莱山区某养殖场。主要试剂EASYPUREVIRALDNA/RNAKIT和一步法RTPCR检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为2/5国产分析纯。引物设计与合成根据GENBANK上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列设计引物。F5GGTATAGTGTGGGTTGCTG3，R3CCTTAATACCTTCCTCATTC5，扩增片段大小为459BP，引物由生工生物工程股份有限公司合成。病毒的增殖经尿囊腔接种倍稀释的IBV，37培养，弃去24H内死亡的，72H后收取尿囊液。病毒本文由论文联盟HTTP/收集整理RNA的提取参照EASYPUREVIRALDNA/RNAKIT说明书进行。一步法RTPCR的建立采取20L的反应体系，按照试剂盒介绍的方法进行。在反应体系中分别加入RNATEMPLATE1L，2ONESTEPREACTIONMIX10L，TRANSSCRIPTTMONE，RNASEFREEWATER加至总体积20L，采取的扩增程序为945MIN；9430S，5530S，72MIN30个循环；7210MIN，PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳鉴定。特异性试验用建立的一步法RTPCR分别检测IBV、IBDV和3/5NDV，验证该方法检测IBV的特异性。敏感性验证将已定量的IBV毒株提取的RNA进行10倍倍比稀释，稀释度分别为10110，用建立的一步法RTPCR进行检测，验证该方法的敏感性。田间试验采用建立的一步法RTPCR检测方法，对大规模养殖场2016年采集的3批60份样品进行IBV监测，疑似阳性则用鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和琼脂扩散试验以鉴定病毒。结果与分析1PCR扩增产物的鉴定PCR扩增产物经过1琼脂糖凝胶电泳，在459BP处可见特异性片段，大小与预期相符，见图1。特异性的试验结果用建立的一步法RTPCR同时检测IBV、IBDV和NDV，仅IBV可扩增出约500BP的目的基因条带，而IBDV和NDV及阴性对照均未扩增出目的片段，见图2。表明该方法特异性较好。；4为阴性对照2敏感性的试验结果用建立的一步法RTPCR最低可检出稀释度为10的病毒RNA，即约PG的IBVRNA，见图3。田间试验结果4/52016年采集大规模养殖场采集的3批60份样品进行IBV监测，采用所建立的一步法RTPCR检测方法，筛选检测阳性共5份，阳性率为。样品经鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和ELISA试验，结果完全符合。3讨论近年来，传染性支气管炎病的流行出现了新的特点，其剖检症状不典型，给临床诊断带来很大的困扰，而目前检测IBV的常用实验室方法有病毒分离3、琼脂扩散试验3、ELISA4、RTPCR5，这些方法各有优缺点病原的分离鉴定是临床上诊断IBV的重要方法，但是该方法操作繁琐，检测周期长6；琼脂扩撒试验操作简单，但敏感性不高，该方法一般多用于检测IBV抗原，不推荐检测IBV抗体7；ELISA检测IBV的优点比一般的血清学试验均敏感，但此法的缺点不能区分抗体是何种毒株刺激机体产生的1；RTPCR技术具有灵敏、快速、特异性强、操作简单等特点。两步法RTPCR反应一般在PCR仪上先花费的反转录时间，再停机加入PCR反应试剂进行下一步的PCR反应，操作繁琐，而且花费很多试剂准备试剂、加样。而一步法RTPCR技术只需将反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物5/5可直接点样电泳，此一步法操作简便易行，而且最大限度地降低了外来因素的污染，更适合广大