恶性黑素瘤细胞株细胞间粘附分子1的改变及临床意义

精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创1/9恶性黑素瘤细胞株细胞间粘附分子1的改变及临床意义【摘要】目的探讨细胞间粘附分子1ICAM1在恶性黑素瘤细胞株的表达及临床意义。方法用体外细胞培养方法、逆转录聚合酶链反应技术，观察恶性黑素瘤细胞株MM81在温热及某些细胞因子刺激下，细胞形态、细胞增殖能力及ICAM1的基因水平变化。结果温热、干扰素、肿瘤坏死因子可使细胞形态改变、细胞增殖能力下降、ICAM1的表达增加，白介素2未能影响细胞形态及增殖能力，也未能使ICAM1明显改变。结论恶性黑素瘤细胞株ICAM1的表达与细胞被破坏有关，同时为温热、干扰素、肿瘤坏死因子作为治疗恶性黑素瘤的辅助手段提供了理论依据。【关键词】黑素瘤细胞因子细胞间粘附分子1逆转录聚合酶链反应THEEXPRESSIONOFINTERCELLULARADHESIONMOLECULE1INHUMANMALIGNANTMELANOMACELLLINESANDITSCLINICALSIGNIFICANCEXIAJIANXIN，JNAKAYAMA，KURABE，ETALDEPARTMENTOFDERMATOLOGY，SECONDHOSPITAL,NORMANBETHUNEMEDICALUNIVERSITY，CHANGCHUN130041精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创2/9【ABSTRACT】OBJECTIVETOINVESTIGATETHEEXPRESSIONOFICAM1INHUMANMALIGNANTMELANOMA（MM）CELLLINESANDITSCLINICALSIGNIFICANCEMETHODSHUMANMMCELLLINESWERECULTUREDANDANALYZEDBYREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION（RTPCR）,THECELLSHAPE，CELLGROWTHABILITYANDICAM1BYMRNAEXPRESSIONUNDERTHESTIMULATIONOFHYPERTHERMIAORCYTOKINESWEREOBSERVEDRESULTSHYPERTHERMIA、IFNANDTNFCOULDCHANGECELLSHAPE，REDUCECELLGROWTHABILITYANDINCREASETHEEXPRESSIONOFICAM1IL2COULDNOTINFLUENCETHECELLSHAPEANDTHEEXPRESSIONOFICAM1CONCLUSIONTHEEXPRESSIONOFICAM1INMMCELLLINESMAYBECORRELATEDWITHTHECELLDESTRUCTION，WHICHPROVIDESTHEORETICALBASISOFSUPPLEMENTARYTHERAPYFORMMWITHHYPERTHERMIA、IFNANDTNF【KEYWORDS】MELANOMACYTOKINEINTERCELLULARADHESIONMOLECULE1REVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION人恶性黑素瘤MM细胞细胞间粘附分子1ICAM1的发现在国外有多家报道1，认为MM患者血清中可溶性精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创3/9ICAM1的浓度与肿瘤进展程度呈正相关。作为MM的辅助治疗手段有温热疗法及细胞因子等。以前曾观察到培养人MM细胞株在体外进行温热及干扰素IFN、肿瘤坏死因子TNF处理后，细胞表面ICAM1的表达及培养液中ICAM1的释放增加2。为探求在温热及细胞因子刺激下MM细胞株ICAM1的表达发生改变的机理，我们将人MM细胞株在温热及某些细胞因子刺激下，观察细胞形态和增殖能力及ICAM1的基因水平变化，现报道如下。材料与方法一、材料1培养细胞恶性黑素瘤细胞株MM81是从恶性黑素瘤患者淋巴结转移灶分离培养而确立起来的，保存于日本九州大学医学部皮肤科教室，细胞培养采用文献3的方法进行。2细胞因子及试剂IFN、TNF和白介素2IL2均由大日本制药株式会社提供，ICAM1引物由日本九州大学医学部皮肤科教室提供，ICAM15为AATGCCCAGACATCTGTG，ICAM13为GCGTAGGGTAAGGTTCTT，提取RNA及逆转录聚合酶链反应RTPCR试剂均为日本宝酒造株式会社生物事业部门提供，此对引物扩增片段为327BP。精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创4/9二、方法1温热实验将人MM细胞配成浓度为1104个/ML，取2ML放入培养皿中培养24H贴壁，更换培养液后分别置入37C、41C、43C含5CO2的培养箱中培养，3H和6H后观察细胞形态，停止温热处理，重新放入37C培养箱中培养，经过约3D恢复后，观察细胞形态，计数，41C6H、43C6H及对照组做RNA的提取及RTPCR。表1温热及某些细胞因子刺激下恶性黑素瘤细胞增殖能力的改变不同处理细胞株数细胞数1105与对照组比较T值P值组间比较T值P值对照组3416H3436H3IFN100U/ML3TNF100U/ML3IL2100U/ML3IFNTNF10U/ML3IFNTNF100U/ML32细胞因子刺激实验将上述细胞同时做细胞因子刺激实验，浓度为1104个/ML，贴壁培养24H，更换培养液后分别加入10U/ML、100UML的IFN、TNF、IL2及精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创5/9IFNTNF，37C培养72H后观察细胞形态，计数，收集IFN、TNF、IL2组细胞浓度均为100U/ML，做RNA的提取及RTPCR。3RNA的提取将细胞剥离用胰蛋白酶EDTA，放入15CM的离心管中2000R/MIN5MIN离心，弃上清液；放入表面活性剂CATRIMOX14TM1ML溶解细胞，并将此溶液移回原试管中；1000R/MIN5MIN，弃上清液；加入锂试剂1ML，振动，15000R/MIN5MIN，弃上清液；加入冷的70乙醇1ML洗沉淀物，吸净乙醇，干燥10MIN；放入50LDEPC水溶液，溶解沉淀物，70C保存。4ICAM1的RTPCR逆转录反应前先将标本90C5MIN处理后再置于冰上急剧冷却。逆转录反应试剂为3引物1L终浓度MOL/L，10RNAPCR缓冲液2L，MGCL24L终浓度5MMOL/L，DNTPS8L终浓度1MMOL/L，核苷酸酶抑制剂L1U/L，逆转录酶1L025UL，样本2L，RNA酶自由水L。逆转录反应条件42C30MIN，99C5MIN，5C5MIN，此时已合成CDNA。PCR反应试剂为MGCL26L终浓度25MMOL/L，5引物1L终浓度02MOL/L，RNAPCR缓冲液8L，TAQ酶L，加DEPC水补至100L，TAQ酶于98C预变性5MIN后加入。反应条件精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创6/994C30S，55C30S，72，共35个循环，末次置72C7MIN，反应结束后，取10L反应产物在含溴化乙锭EB的15琼脂糖凝胶中电泳30MIN，紫外灯下观察结果。为了避免各标本中总RNA的差异，用肌动蛋白测各标本中总RNA量。5ICAM1CDNA量的测定4及结果分析电泳后，用CCDCHARGECOUPLEDDEVICE影像系统测定每条带的EB荧光密度，将ICAM1CDNA的EB荧光密度除以肌动蛋白的EB荧光密度得出ICAM1MRNA专用单位。因肌动蛋白MRNA在同一种细胞的含量是一致的，其量与总RNA的量成正比，其意义在于消除加样不均所致的每一样本MRNA量的不一致。表2各样本的ICAM1MRNA荧光密度及其相对值MRNA对照TNFIFNIL2416H436HICAM1242825390352484200532262833874肌动蛋白275901990321580353183540225106ICAM1/肌动蛋白结果1细胞形态学改变温热及IFN、TNF均可改变细胞形态，表现为细胞形态不规则，胞膜不清，大小不等，温度越高，热处理时间越长，细胞形态变化越明显。细胞因子中尤以TNF与IFN合用细胞形态改变最明精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创7/9显。2细胞增殖能力的改变如表1，数据处理采用T检验。1CDNA量的测定如表2，从中可以看出TNF100U/ML使ICAM1增加倍/，IFN100U/ML使ICAM1增加倍/，436H使ICAM1增加倍/，IL2及416H未能使ICAM1增加。讨论目前对于肿瘤的治疗除了手术、放疗、化疗以外，还有细胞因子及温热疗法等，某些细胞因子常被应用于肿瘤的辅助治疗如干扰素及肿瘤坏死因子等，本实验中，用IFN、TNF及IL2在体外作用于MM细胞，结果观察到IFN、TNF可破坏细胞，使细胞增殖能力下降，体外实验证实了IFN、TNF的抗肿瘤作用，IL2未能改变细胞形态，也未能影响细胞的增殖能力。日本九州大学医学部皮肤科采用局部温热灌流疗法治疗进行期的四肢MM，通过超声波观察可见肿瘤体积缩小，取得了较好的临床效果5，本实验中，采用41及43处理3H和6H，从中观察到，温热处理后，随着温度的增高，热处理时间的延长，细胞形态变化越明显，细胞增殖能力下降越明显，与对照组比较及组间比较P作者单位夏建新精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创8/9130041长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科；中山树一郎，占部和敬日本九州大学医学部皮肤科教室；母义明北京解放军第三零一医院内分泌科参考文献1江口弘晃，堀越贵志，高桥诚，他恶性黑色肿ICAM1发现日皮会，1992，1028078142管晓春，中山树一郎，中岛学，他恶性黑色肿细胞ICAM1发现可溶性ICAM1放出变动关研究日皮会，1997，1077477533NAKAYAMAJ，MOROIY，TOSHITANIA,ETALRESPONSESOFB16MELANOMACELLLINES,F1ANDF10,TOHYPERTHERMIALYMPHOKINEACTIVATEDKILLERCELLSANDACOMBINATIONOFBOTHINVITROBRJDERMATOL，1992，1261311364YOKOIH，NATSUYAMAS，IWAIM，ETALNONRADIOISOTOPICQUANTITATIVERTPCRTODETECTCHANGESINMRNALEVELSDURINGEARLYMOUSEEMBRYODEVELOPMENTBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN，1993，1957697755NAKAYAMAJ，TAKEUCHIM，NAGAES，ETALHYPERTHERMICISOLATEDLIMBPERFUSIONWITHINTRA精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创9/9ARTERIALADMINISTRATIONOFCARBOPLATINANDORINTERFERONFORTHETR