b基因表达产物与心肌细胞缺血的关系及与a药物保护损伤的关系

【实验设计内容和要求】已知（1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变试通过设计细胞生物学实验明确（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系（2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中【背景资料】心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。冠心病是引起心肌缺血最主要、最常见的病因。随着人民生活水平的提高，目前心肌缺血在我国的患病率呈逐年上升的趋势。心肌缺血是中老年人的常见病和多发病。【实验思路】1，验证是B基因表达产物影响了心肌缺血，还是心肌缺血导致B蛋白表达量改变（因已知心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变，故只需改变B基因表达，以此为变量，检测是否对心肌缺血有影响）2，施以A药物进行对照实验，验证此过程中B基因表达产物的变化（在实验一已证明B基因表达产物影响心肌缺血的基础上，进行实验二，检测A药物是否是通过改变B基因的表达，从而发挥作用。）【相关技术介绍】SIRNA沉默基因RNA干涉（RNAI）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（DSRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。SIRNA在RNA沉默通路中起中心作用，是对特定信使RNA（MRNA）进行降解的指导要素。IRTPCR反转录聚合酶链反应（REVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION,RTPCR）将RNA的反转录和CDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合。首先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的MRNA作为模板，采用OLIGO（DT）或随机引物利用反转录酶反转录成CDNA。再以CDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。II免疫组化抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学利用这一原理，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。IIIWESTERNBLOT采用是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。IV凋亡基因BAX表达目前研究表明，许多基因参与了细胞凋亡的调控,其中FAS，BCL2，BAX，P53等基因发挥了重要的作用，关于它们在细胞凋亡的作用机制已经做了大量深入的研究。本次实验采用免疫组化的方法，对心肌细胞在B基因沉默后的表达水平进行检测，探讨B基因表达产物在心肌细胞缺血导致细胞凋亡的作用机制。实验一，验证B基因表达产物影响心肌缺血【实验设计】将实验分为4组B基因SIRNA转染组空载体转染组（转染无关序列）心肌缺血模型组（不转染）空白对照组（不转染，不制备缺血损伤）每组再分别进行如下四个指标的检测1，B基因MRNA的表达检测转染效率2，WESTERNBLOT检测B蛋白表达3，调亡基因BAX，BCL2表达，细胞形态观察检测心肌细胞凋亡情况4，乳酸脱氢酶LDH，肌酸激酶（CK）测定心肌细胞缺血情况【实验过程】1，培养成年大鼠心肌细胞采用装置，、型胶原酶灌注法分离提取成年大鼠心肌细胞，心肌细胞以孔的密度平铺于层粘连蛋白预处理过的孔板中，培养基培养过夜备用。常规免疫组化法检测大鼠心肌细胞肌动蛋白的表达，鉴定心肌细胞。V2，SIRNA转染设计并体外合成靶向大鼠心肌细胞B基因的特异SIRNA、以及无关序列对照（空载体对照）。转染前提取培养心肌细胞贴壁过夜，细胞密度为孔；润洗心肌细胞次，每孔加入培养基和混合好的转染混合物（），轻轻摇匀，培养箱孵育。吸去转染混合液后加入正常无血清培养基继续培养3，心肌细胞缺血损伤采用不含葡萄糖的无菌液，调节至，然后在缺氧（）培养箱中平衡即为缺氧液。取需要缺氧处理的心肌细胞，小心去除原培养基，加入模拟缺氧溶液（孔）后，置入缺氧培养箱（，）。将缺氧后心肌细胞自氮气缺氧培养箱中取出，小心去除缺氧液，每孔重加入（）无血清培养基，放回正常培养箱至预定时间。VI4，RTPCR检测B基因MRNA的表达采用半定量RTPCR。TFIZOL试剂提取总RNA，按REVERTRAACERTPCR试剂盒在MYCYCLERPCR仪上进行两步法RTPCR。目的片段循环扩增35次，PCR产物经15琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统扫描测定目的片段和BACTIN扩增产物的吸光度比值。5，WESTERNBLOT定量检测B蛋白的表达采用流式细胞法检测。收集各组细胞106个，按INTRAPREPTM细胞内染色试剂盒说明进行操作，依次加入固定剂、穿透剂处理细胞，加小鼠抗大鼠B蛋白抗体，室温孵育2H后PBS洗涤细胞2次，加FITC标记抗小鼠IGGL抗体1P,G，室温避光孵育45MIN后PBS洗涤细胞2次，于BECKMANCOULTEREPICSXL流式细胞仪上进行检测，以阳性率表示B蛋白相对含量。6，检测调亡基因BAX和BCL2用PBS001MOLL1PH74冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L03的过氧化氢甲醇溶液室温处理30MIN,以阻断内源性过氧化酶。PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L正常非免疫动物血清,室温处理20MIN,吸去多余的液体。每张切片加50L第一抗体,室温湿盒孵育60MIN,PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L生物素标记的第二抗体,室温湿盒孵育30MIN,PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶溶液,室温湿盒孵育10MIN,PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加100L新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察10MIN,自来水冲洗,苏木素复染,中性树胶封固。将SP免疫组化切片于光镜下400倍放大,通过图像分析仪每张切片随机选择10个视野,测定蛋白阳性表达指数POSITIVEEXPRESSIONINDEX,PEI,PEI平均光密度阳性细胞百分比100。7，乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）测定收集各实验组培养细胞上清液，在全自动生化仪上检测LDH，CK含量。【实验结果】若B基因表达产物影响了心肌缺血，则阳性结果是1，RTPCR检测，B基因SIRNA转染组的B基因MRNA表达水平低于其他三组（有统计学意义），表示出实验中对B基因的沉默有效。2，WESTERNBLOT检测，B基因SIRNA转染组B蛋白的表达水平低于其他三组（有统计学意义），才能进而证明接下来的实验中，是B蛋白的表达水平造成了心肌细胞缺血的差异。3，B基因SIRNA转染组心肌细胞调亡基因BAX和BCL2表达水平与空载体转染组和空白对照组的差别有统计学意义，凋亡形态差距明显。4，B基因SIRNA转染组中乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）含量与空载体转染组和空白对照组差距有统计学意义，表示B基因对心肌缺血有影响。5，可将心肌缺血模型组的BAX和BCL2表达，心肌细胞凋亡形态，乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）含量作为标准的凋亡参照。6，空载体转染组和空白对照组的各项指标之间对比不应有统计学意义。实验二，验证A药物对B基因表达产物的影响【实验设计】将实验分为3组假手术组缺血损伤组A药物干预组（002ML/KG，005ML/KG，010ML/KG）每组进行如下三个指标的检测1，血清中LDH和CK含量测定2，WESTERNBLOT检测B蛋白表达3，免疫组化检测B蛋白表达【实验过程】1，大鼠心肌缺血模型及假手术组，A药物干预组制备将大鼠用10水合氯醛035ML/100G腹腔注射使其麻醉，仰卧位固定于大鼠手术台上，颈正中纵行切口作气管插管，连呼吸机，按1015ML/100G潮气量，4050次/MIN的频率给予呼气末持续正压呼吸，呼吸比为11，压力在01KPA之间。将心电图机针形电极插入大鼠四肢皮下，记录正常标准导联心电图。剪去胸前手术区毛，用角针在手术区周围穿荷包缝合线，欲留线头不结扎。在胸前作34CM长纵形切口，剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜，然后于胸骨左侧第四肋间，用止血钳钝性分离肋间肌3CM，打开胸腔，轻压胸廓，将心脏挤出胸腔。剪开心包膜，用棉球将心脏向右轻推，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到与左冠状动脉伴行的心大静脉，在左心耳下方2MM处用眼科针穿线，进针深度为115MM，宽23MM，连同心大静脉一起结扎左冠状动脉前降支。结扎前于心大静脉处放一段实性玻璃丝引线，与冠状动脉一同结扎。结扎后迅速将心脏放入胸腔，轻挤胸腔排出胸腔气体，同时提拉已穿好的缝皮线并结扎，使胸腔关闭，并使玻璃丝引线尾端留在胸外。再次记录结扎后导联心电图，以ST段明显抬高作为结扎冠脉成功的标志。冠状动脉缺血30MIN后，拔除引线，恢复冠脉血流，再灌注120MIN，再次记录导联心电图。VII假手术组冠状动脉下穿线不结扎，手术前30MIN腹腔注射生理盐水005ML/KG；A药物干预组结扎冠状动脉，手术前30MIN腹腔分别注射A药物002ML/KG，005ML/KG，010ML/KG。2，血清中LDH和CK含量测定缺血再灌注120MIN后，由腹主动脉取血810ML置于塑料试管中，血液凝固后立即在4下，3000RPM离心10MIN分离血清。采用半自动生化测定仪，按LDH和CK试剂盒说明书操作，测定血清LDH含量和CK含量。3，WESTERNBLOT检测B蛋白表达采用流式细胞法检测。收集各组细胞106个，按INTRAPREPTM细胞内染色试剂盒说明进行操作，依次加入固定剂、穿透剂处理细胞，加小鼠抗大鼠B蛋白抗体，室温孵育2H后PBS洗涤细胞2次，加FITC标记抗小鼠IGGL抗体1P,G，室温避光孵育45MIN后PBS洗涤细胞2次，于BECKMANCOULTEREPICSXL流式细胞仪上进行检测，以阳性率表示B蛋白相对含量。4，免疫组化检测B蛋白表达用PBS001MOLL1PH74冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L03的过氧化氢甲醇溶液室温处理30MIN,以阻断内源性过氧化酶。PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L正常非免疫动物血清,室温处理20MIN,吸去多余的液体。每张切片加50L（B蛋白）第一抗体,室温湿盒孵育60MIN,PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L生物素标记的第二抗体,室温湿盒孵育30MIN,PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加50L链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶溶液,室温湿盒孵育10MIN,PBS冲洗3次,每次5MIN,每张切片加100L新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察10MIN,自来水冲洗,苏木素复染,中性树胶封固。将SP免疫组化切片于光镜下400倍放大,通过图像分析仪每张切片随机选择10个视野,测定蛋白阳性表达指数POSITIVEEXPRESSIONINDEX,PEI,PEI平均光密度阳性细胞百分比100。【实验结果】若在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，影响了B基因的表达产物，进而导致A药物发生作用，则阳性结果是1，血清中LDH和CK含量测定，心肌缺血损伤组假手术组A药物干预组（有统计学意义），证明心肌缺血模型，以及A药物保护模型构建成功。2，WESTERNBLOT检测心肌缺血损伤组B蛋白的表达水平，A药物干预组，心肌缺血损伤组和假手术组之间有明显差异。若A药物介导B基因表达产物上调，从而保护心肌细胞免受缺血损伤，（B蛋白的下降促进了缺血损伤），则结果为B蛋白含量，A药物干预组假手术组心肌缺血损伤组若A药物介导B基因表达产物下降，从而保护心肌细胞免受缺血损伤，（B蛋白的上升促进了缺血损伤），则结果为B蛋白含量，心肌缺血损伤组假手术组A药物干预组3，免疫组化检测检测，心肌缺血损伤组B蛋白的表达水平与假手术组和空白对照组的差别有统计学意义，结果同上【注意】实验二是建立在实验一证实了B基因表达产物的改变影响了心肌缺血的基础上。换句话说，B蛋白表达改变在前，心肌缺血在后。若实验一的结果不是阳性，则会是心肌缺血导致了B基因表达产物的改变，即，先缺血损伤，B蛋白表达再改变。那么实验二的结果就没有意义。实验一的前提下，若A药物是通过别的途径保护心肌细胞免受缺血损伤，则在心肌缺血的诸多影响因素中，B蛋白表达量不应受到太大影响，故实验二在实验一阳性的结果下有意义。【参考文献】本文中具体实验操作步骤1，大鼠缺血损伤模型制备，血清中LDH和CK含量测定来自于赵丽晶牛磺酸对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用D吉林大学,20062，心肌细胞缺血模型制备，转染SIRNA，WESTERNBLOT检测B蛋白表达，RTPCR检测B基因MRNA的表达来自于张建,汤全,梁贵友,等SIRNA沉默PPAR基因对大鼠心肌细胞缺血再灌