【毕业论文】mirna-210调控notch信号通路在激素性骨坏死血管新生中的作用

学位论文独创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。论文中除特别标注的内容外，不包含任何其他个人或机构已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。本声明的法律结果由本人承担。作者签名日期复旦大学学位论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关收藏和利用博士、硕士学位论文的规定，即学校有权收藏、使用并向国家有关部门或机构送交论文的印刷本和电子版本；允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。涉密学位论文在解密后遵守此规定。作者签名导师签名日期目录缩略词表1中文摘要2英文摘要3前言5正文7国内外研究现状7材料与方法13结果17结论与讨论32参考文献39全文小结43附录44后记及致谢56缩略词表ABBREVIATION英文缩略词英文全称中文译名ONFHOSTEONECROSISOFFEMORALHEAD股骨头坏死OAOSTEOARTHRITIS骨关节炎BMSCBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS骨髓间充质干细胞VEGFVASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR血管内皮生长因子MIRNAMIRCORIBONUCLEICACID微小核糖核酸CBFCPROMOTERBINDINGFACTORC启动子结合因子SVSLOWVIRUS慢病毒中文摘要目的研究MIRNA210调控NOTCH信号通路在激素性骨坏死的病理作用机理，探索临床激素性骨坏死防治的新方向。材料与方法选取60只10周龄的雌性SD大鼠，随机均分为实验组与对照组，每组30只，采用甲强龙连续肌注3次建立大鼠ONFH模型。于造模结束后4周（A组）、8周（B组）、12周（C组）将实验组与对照组的大鼠各处死1/3（10只），取双层股骨头，一侧用于病理切片制作，另一侧进行MIRNA210和NOTCH信号通路表达的检测，并验证MIRNA210和NOTCH表达量的相关性。结果（1）HE染色切片A组实验组和对照组均未见明显骨坏死；B组可见实验组的骨坏死率明显高于对照组；C组实验组的骨坏死率高于对照组，且介入A组和B组之间。（2）NOTCH1免疫组化染色A组和B组的实验组与对照组均未见明显NOTCH1染色团块；C组对照组未见明显NOTCH1染色团块，实验组可见较为明显的NOTCH1染色团块。（3）MIRNA210表达检测A组实验组和对照组之间MIRNA210的表达无明显统计学差异（P005）；B组和C组实验组组与对照组之间MIRNA210的表达有统计学差异（P005）。（4）NOTCH信号通路表达检测A组和B组实验组和对照之间NOTCH信号通路的表达无明显统计学差异（P005）；C组实验组组与对照组之间NOTCH信号通路的表达有统计学差异（P005）。（5）相关性检测A组和B组NOTCH通路中各个组分的表达量与MIRNA210均未见明显相关性（R08）；C组中NOTCH1以及HES1的表达量与MIRNA210有明显相关性（R08）；RBPJK的表达量与MIRNA210无明显相关性（R08）。结论通过本次实验，证明MIRNA210和NOTCH信号通路在激素性骨坏死中晚期表达量增高，可能与骨坏死的修复相关。关键词激素性骨坏死；MIRNA210；NOTCH信号通路中图分类号R3ABSTRACTINTRODUCTIONANDOBJECTIVESTHISPAPERSTUDIESTHERELATIONSHIPBETWEENSIGNALINGNOTCHCONTROLLEDBYMIRNA210ANDTHEREPAIROFONFH,ANDESTABLISHSOMENEWWAYSOFPREVENTIONANDTREATMENTMATERIALSANDMETHODSTHISPROJECTWASDONEWITH60SDRATS,FEMALE,10WEEKS60RATSWASRANDOMLYDIVIDEDINTOTWOGROUPSTHEEXPERIMENTALGROUPANDTHECONTROLGROUP,EACHGROUPHAS30RATSTHEONFHMODELWASESTABLISHEDBYINJECTIONOFPREDNISOLONE3TIMESAT4WEEKSGROUPA,8WEEKSGROUPB,12WEEK3GROUPCAFTERTHEMODELWASESTABLISHED,EXECUTED1/3OFBOTHTHEEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPANDTOOKOUTFEMORALHEADS,ONESIDEWASFORPATHOLOGICALSECTION,ANDANOTHERWASFORTHEEXPRESSIONOFMIRNA210ANDSIGNALINGNOTCHRESULTS1HESECTIONGROUPATHEREWASNOOBVIOUSOSTEONECROSISINBOTHEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPGROUPBTHENECROSISRATEOFEXPERIMENTALGROUPISHIGHERTHANCONTROLGROUPGROUPCTHENECROSISRATEOFEXPERIMENTALGROUPISHIGHERTHANCONTROLGROUPANDWASBETWEENGROUPAANDGROUPB2NOTCH1SECTIONGROUPAANDGROUPBTHEREWASNOOBVIOUSDYEINGMASSINBOTHEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPGROUPCTHEREWASNOOBVIOUSDYEINGMASSINCONTROLGROUP,BUTTHEREWASOBVIOUSDYEINGMASSINEXPERIMENTALGROUP3THEEXPRESSIONOFMIRNA210GROUPATHEREWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEOFTHEEXPRESSIONBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP005GROUPBTHEREWASASIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP005GROUPBTHEREWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP005GROUPCTHEREWASASIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPP08THEEXPRESSIONOFRBPJKISNOTRELATIVETOTHEEXPRESSIONOFMIRNA210R08CONCLUSIONTHEEXPRESSIONOFMIRNA210ANDSIGNALINGNOTCHWASRAISEDINTHELATESTAGEOFONFHANDTHEYMAYBEINRELATIONSHIPWITHTHEREPAIROFONFHKEYWORDSSTEROIDINDUCEDOSTEONECROSIS,MIRNA210,SIGNALINGNOTCHCHINESELIBRARYCLASSIFICATIONR3前言糖皮质激素导致的股骨头坏死（OSTEONECROSISOFFEMORALHEAD,ONFH）是临床最为常见的骨科疾病之一，多始发于青壮年，我国的平均发病年龄约为42岁，总发病率占非创伤性股骨头坏死总发病率的469左右，是非创伤骨坏死的首要病因1。其临床表现早起以髋关节疼痛、僵硬、活动受限等，晚期常导致股骨头塌陷，髋关节面破坏，关节间隙狭窄等致残性改变。目前临床治疗激素性骨坏死的方案很多，但尚无意见一致的理想方法，而且由于早起疾病难以发现，往往导致患者错过最佳就诊时机，延误治疗，产生巨大的经济和社会负担。另一方面，相对于其高发病率和危险性，骨坏死的发病机制仍然尚不明确，因此探索其发病机制，寻找早起有效的预防、治疗措施一直是国内外对于ONFH研究是重点和难点所在。目前对于激素性骨坏死发病机制的主流观点包括骨代谢异常、脂代谢异常、骨细胞分化障碍、细胞凋亡等几个方面24，每一种学说均有其支持和反对的依据，尚无统一理论能涵盖以上所有学说。近几年许多研究表明，糖皮质激素会作用于骨髓基质干细胞，从而影响其成骨和成脂分化的平衡，进一步造成成骨和破骨代谢的失衡，大量骨质丢失，是激素性骨坏死的主要病理机制56。然而奇怪的是，一些临床上抑制破骨的药物，如二磷酸盐等，使用后也会产生下颌骨缺血性坏死的并发症7，似乎与之前成、破骨代谢失衡导致骨坏死的理论相违背。之后的一些研究发现，这些药物在抑制破骨细胞功能的同时，也会抑制血管内皮生长因子（VEGF）的成血管作用，造成局部微血管新生障碍，破坏微循环，导致缺血性骨坏死的发生89。综上所述，微循环的破坏合并成骨成脂代谢障碍可能是激素性骨坏死的主要发生机理，因此防止微循环的破坏、促进血管新生将会是早起预防和治疗ONFH的重要方向之一，具有重要的理论和临床意义。另一方面，MIRNA210是低氧低血供诱导表达的众多MIRNA之一，并且在其中占有重要的主导地位，调控下游VEGF、NOTCH等多个信号通路的表达10。目前已经有多项研究表明MIRNA210控制的信号通路在心、肾、脑等器官的血管新生中具有十分重要的作用；而抑制MIRNA210的表达将使血管内皮细胞对缺血缺氧等刺激条件的反应性大幅下降，进一步影响其在缺血性疾病后期的修复过程11。但是在骨骼缺血性坏死的病理过程中，MIRNA210的作用并没有得到足够的研究和阐明，若是能够明确MIRNA210在骨坏死血管新生中作用，将会是对其预防和治疗的一大突破。参考文献1ZHAOFC,ZHUANGQY,GUOKJCLINICALANALYSISOFOSTEONECROSISOFTHEFEMORALHEADINDUCEDBYSTEROIDJORTHOPSURG2012,4128342GONGLL,FANGLH,WANGHY,ETALGENETICRISKFACTORSFORGLUCOCORTICOIDINDUCEDOSTEONECROSISAMETAANALYSISJSTEROID2013,2521243PAKOSCHD,PAPADIMASD,MUNDINGJ,ETALOSTEONECROSISOFTHEMANDIBLEDUETOANTIANGIOGENICAGENTJORALMAXILLOFACSURG2012,1645494WANGYS,WANGYH,ZHAOGO,ETALOSTEOGENICPOTENTIALOFHUMANCALCITONINGENERELATEDPEPTIDEALPHAGENEMODIFIEDBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSJCHINMEDJ2011,12423376815TANG,KANGPD,PEIFXGLUCOCORTICOIDAFFECTTHEMETABOLISMOFBONEMARROWSTROMALCELLANDLEADTOOSTEONECROSISOFFEMORALHEADJCHINMEDJ2012,125113496FANGUSAROJ,GURURANGANS,JAKACKIRI,ETALBEVACIZUMABINDUCEDOSTEONECROSISOFWRISTANDKNEEINTHREEPEDIATRICPATIENTSWITHCURRENTCNSTUMORSJJCLINONCOL2013,3122477VINCENZIB,NAPOLITANOA,ZOCCOLIA,ETALSERUMVEGFLEVELSASPREDICTIVEMARKERSOFBISPHOSPHONATERELATEDOSTEONECROSISOFJAWJJHEMATOLONCOL2012,175568LIUY,BERENDSENAD,JIAD,ETALINTRACELLULARVEGFREGULATESTHEBALANCEBETWEENOSTEOBLASTANDADIPOCYTEDIFFERENTIATIONJJCLININVEST2012,1229101139MALANJ,ETTINGERK,NAUMANNE,ETALTHERELATIONSHIPOFDENOSUMABPHARMACOLOGYANDOSTEONECROSISOFJAWJORALSURGORALMEDORALPATHOLORALRADIOL2012,1146671610CAPORALIA,EMANEULICMICRORNASINPOSTISCHEMICVASCULARREPAIRJCARDIOLRESPRACT2013,33219320011HUANGF,ZHUX,HUXQ,ETALMESENCHYMALSTEMCELLSMODIFIEDWITHMIRNA126RELEASEANGIOGENICFACTORSANDACTIVATENOTCHLIGANDDELTALIKE4,ENHANCINGISCHEMICANGIOGENESISANDCELLSURVIVALJINTJMOLMED2013,31248492正文激素性骨坏死是骨科临床最为常见和主要的疾病之一，但是对于激素性骨坏死的发病机制仍然不甚清楚，各种理论还不能得到统一。然而无论是哪种理论，骨局部血供的减少、微循环的破坏都是导致骨坏死发生的直接原因之一。因此减少血供的破坏以及促进血管新生无疑将会是骨坏死后期修复的主要途径。而经由MIRNA210调控的NOTCH信号通路已被证实在其他器官的血管新生中能发挥重要作用，如果能明确其在骨坏死后期修复中的作用的话，将会对临床激素性骨坏死的防治产生重要的帮助。国内外研究现状11血管新生与NOTCH信号通路目前对于血管新生（ANGIOGENESIS）的定义为从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括激活期血管基底膜降解血管内皮细胞的激活、增殖、迁移重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管新生是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。CARLIER等的研究证实，血管新生与传统认识的血管生成不同，是通过出芽的方式完成的1。整个过程起始于缺血后低氧环境对血管内皮细胞的刺激，VEGF表达量上升，使端细胞（TIPCELL）选择性激活，依据VEGF浓度梯度趋化生长，然后NOTCH信号通路被激活，促使内皮中的柄细胞STALKCELL增殖迁移，形成管腔。两个或多个部位形成的管腔连接在一起，完成血管新生的过程2。血管生成过程中需要血管内皮细胞EC与细胞外基质间、EC与EC间及EC与其他周围细胞间的相互作用。无疑血管内皮细胞是血管新生过程中发挥主要作用的细胞，而血管内皮细胞生长因子（VEGF）则是这个过程中调控血管发育的最主要的信号通路，目前发现的VEGF家族共有5个受体和5个配体，它的表达受缺血缺氧环境、机械应力、脂肪代谢等多个因素影响，并在内皮细胞激活、增殖迁移、出芽等多个血管新生的重要方面都发挥着调控作用34。但是，另一方面，VEGF并不能单独控制整个血管新生的过程，有许多与它相互影响的信号通路共同参与对血管新生的调节，其中NOTCH信号通路就是最为常见和重要的信号通路。血管新生的具体信号通路见图111。图111血管新生相关信号通路。NOTCH信号通路是一条高度保守的信号通路，最早于1919年由科学家MORGAN在果蝇身上发现5，能够影响细胞正常形态发生的多个过程，包括多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成。哺乳动物的NOTCH信号通路由4个受体（NOTCH14）和5个配体（DELTALIKE1，2，3以及JAGGED1,2）组成。NOTCH信号通路的激活方式主要分为两种经典的CSL依赖通路和CSL非依赖通路，其中CSL是一种转录抑制因子，它能在NOTCH信号通路的表达中其关键的调节作用。这两者的区别在于前者NOTCH受体与配体结合后，释放出的信使通过与CSL结合的方式，激活信号通路的表达，是较为主要的表达方式；而后者则是与细胞内的锌指蛋白等物质结合，通过调控其他的转录抑制因子从而实现信号通路的表达。然后，借由激活下游靶分子，如HES1、HES5等，发挥自身的作用67。NOTCH信号通路的具体组成见图112。图112NOTCH信号通路组成。目前，NOTCH信号通路已经被发现广泛存在于心脏、脑、肾脏等多个组织器官中，尤其是NOTCH1受体，在心肌中大量表达，LAWSON等的实验表明，如果在胚胎期NOTCH1发生突变，会导致心血管系统发育异常而使小鼠死亡8。而NOTCH3则主要表达表达于平滑肌细胞，如果NOTCH3发生突变，临床上会引起大脑常染色体显性动脉病，常伴有血管平滑肌的退化造成中风和痴呆9；而DOMENGA等的研究则发现，NOTCH3敲除后，血管平滑肌标志物之一的SMOOTHELIN的表达量会明显下调，而大鼠则会出现血管发育障碍的症状，如肢端坏死等10。另一方面，THURSTON和MORROW等则发现了NOTCH通路的配体，如DLL4和JEGGED1等，在肿瘤新生血管中占有重要的地位，并且不同受体的不同表达量可能同时在血管新生的促进和抑制两方面发挥作用1112。另外也有学者认为，NOTCH信号通路可能是VEGF通路的一种负调节机制，VEGF负责血管的新生，而NOTCH则能促进新生血管的成熟，防止血管增生过度13。无论如何，NOTCH通路在血管新生的调控中占有不可忽视的地位，这一点都是毋庸置疑的，这种调控作用可能会影响到一些外源性的因子对血管的治疗作用。12MIRNA210对NOTCH信号通路的调控MIRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约2025个核苷酸。成熟的MIRNAS是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶MRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶MRNA或者阻遏靶MRNA的翻译。最近的研究表明MIRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等14。国内外均有研究证明在VEGF和NOTCH信号通路的上游存在多种MIRNA发挥调控作用，影响体内各个器官的血管新生过程。SUAREZ等的研究表明，如果将血管内皮细胞中调节MIRNA生成的DICER基因敲除，造成MIRNA生成障碍的话，会导致内皮细胞对缺血缺氧等环境刺激失去应激性，VEGF的生成量明显受到抑制；而相对的，如果将MIRNA转染的质粒导入基因敲除的内皮细胞中，则可以观察到失去应激性的内皮细胞重新恢复了对环境刺激的应激性，VEGF和NOTCH的表达量也上升至正常值15。HUANGF等人的实验也发现MIRNA在NOTCH信号通路调节心血管系统发育的过程中发挥调控作用，尤其是对DLL1受体的表达至关重要16。而杨阳等人则发现在肾癌模型中，MIRNA可以通过调节NOTCH1和HES1的表达进一步控制肾癌中血管的形成和破坏，这对于肾癌的病理分级有着极大的影响17，从而证明了MIRNA在血管新生中确实的对VEGF和NOTCH等信号通路存在调控作用。缺血缺氧环境诱导表达的MIRNA有多种，包括MIRNA100，MIRNA126，MIRNA210，MIRNA503等，其中MIRNA126和MIRNA210是关键的调控基因。MIRNA126是内皮细胞和血液干细胞特异表达的一种MIRNA，通过对VEGF和NOTCH的调节来影响血管新生过程；而MIRNA210是缺氧特异性MIRNA，在低氧环境中表达量会大幅上升，调控VEGF和NOTCH通路从而在血管再生和内皮细胞功能的稳定中发挥关键作用。对于MIRNA210的研究国内外并不少见，ZHANGXJ的研究发现MIRNA210在胃癌的高转移株和低转移株之间差异性表达，认为MIRNA210可能通过调节胃癌新生血管来影响其远处转移的特性18；刘亚明等人则在肾积水的模型中发现，在缺血缺氧的状态下，MIRNA210能够诱导HIF1和VEGF的表达，从而增加血管新生，调节肾积水后对缺血缺氧环境的适应力19；而张倍源等人的实验则表明，MIRNA210在骨质疏松模型中可以促进骨髓间充质干细胞（BMSC）的成骨分化，确认了MIRNA210在骨骼系统的分化平衡中也发挥着作用20；NIE等人的研究则发现了MIRNA210的表达能在缺氧状态下显著提高MSC的存活能力，抑制凋亡反应的发生21。换句话说，MIRNA210在体内多个组织器官的多种血管新生相关的生理病理过程中都占据着重要的一席之地，对很多情况下的血管新生起到关键的调控作用。MIRNA210结构见图12。图121MIRNA210结构图。另一方面，激素性骨坏死也可以归为缺血性疾病之一，骨骼局部小血管的破坏引起的微循环障碍是其发生的主要原因，因此可以预见到血管新生将会是骨坏死晚期修复过程中的一个重要因素。YAMASAKI等人的实验发现MIRNA210的表达量增高并且分布于坏死病灶周围22；张长青等人也证实了骨坏死患者血浆中的MIRNA210含量要明显高于普通人23。但是MIRNA210在骨坏死修复中的作用仍然没有明确的研究能够确认。我们的前期工作中观察到在骨坏死过程中VEGF和NOTCH信号通路有激活反应，可是在ONFH不同时间段的表达规律以及这些信号通路的激活与骨坏死修复的具体关系仍然不甚明了；除此以外，MIRNA210在骨坏死中是否也如同其他器官一样发挥着对VEGF和NOTCH通路的调控作用也依然是个未知数，如果等阐明这些问题，想必能够对临床ONFH的防治提供一条新的思路。13激素性骨坏死与血管新生股骨头坏死的血供主要由以下三条动脉供应（1）股骨头圆韧带动脉起源于闭孔动脉的一条分支，主要为股骨头凹陷附近骨质供血，老年人次动脉多已经闭塞。（2）支持带动脉从旋股内和旋股外动脉发出，在股骨颈基底处呈环状吻合构成基底动脉环，再分别发出数条颈升动脉，分布至股骨头，提供股骨头和股骨颈的绝大部分血供。（3）股骨干滋养动脉来自股骨干髓腔的滋养动脉，沿股骨干上升至股骨颈出，一般不与股骨头内部的血管产生吻合，供血量较少。这其中支持带动脉是主要的供血动脉，损伤后将影响股骨头大部分血供，所以当股骨颈骨折等情况造成支持带动脉损伤时，即使骨骼愈合完好依然容易导致骨坏死的发生。而激素性骨坏死造成股骨头内缺血的原因很多，包括高凝状态、脂肪栓塞，内部机械压力增高造成的血管闭塞等，目前尚不能确定哪一种原因是造成缺血发生的主要机制。正是因为拥有破坏血供的这种作用，激素以前就被用于类似于肿瘤等富血供疾病的治疗，如GREENBEGER等就发现地塞米松能通过影响血管瘤干细胞功能，减少血管瘤在小鼠体内的血管形成24；而LOGIE的实验则证实了地塞米松能作用于人主动脉内皮细胞，影响其出芽功能，从而造成管状结构的缺陷，抑制血管新生25。股骨头的具体血供见图131图131股骨头血供示意图。在激素性骨坏死的晚期过程中，骨内血管新生与骨质的修复是密不可分的，新生的血管能为骨质带来必须的氧气、营养物质和前体细胞等，而骨质的修复、塑形则可以为血管提供支持和保护，并影响血管的出芽、迁移、粘附等过程。对于骨坏死中的血供破坏和修复已经不乏研究，程少华等人通过观察VEGF在高压氧治疗骨坏死过程的表达规律证实在骨坏死修复过程中血管新生是必要步骤26；FANM等人的研究则证明了有促进成骨活动和血管新生作用的唑来膦酸能在骨坏死股骨头塌陷的预防中起到很好的作用27；WANGHM等人和王灵松等人都发现了通过股动脉内基质干细胞或者单个核细胞移植，增强其成血管能力，对于激素性骨坏死的治疗发挥了良好的效果2829；而最为直接的证据，作为目前治疗骨坏死疗效最为肯定是手术术式之一，带血管蒂腓骨或髂骨瓣移植，也是通过改善股骨头血供和来治疗骨坏死的30。值得一提的是，也有研究认为血管新生不止与骨质形成有关，破骨反应对于血管新生也十分重要。CACKOWSKI等的研究表示，破骨细胞能够通过分泌MMP9来调节VEGF表达，进一步促进缺血区域的血管再生，可以认为是缺血性骨坏死的一种自限机制31。综上所述，血管新生在骨坏死后期修复过程中有着十分重要的地位，在明确骨坏死中血管新生的作用机理后，预防血供破坏和促进血管新生一定会是将来骨坏死防治中的主要方向。材料与方法21实验材料211实验动物取健康清洁级SD雌性大鼠60只，10周龄，体重250G左右，由复旦大学附属中山医院实验动物中心提供。60只大鼠随机均分为实验组和对照组，每组30只，相同条件下采用辐照饲料饲养。饲养条件见图211。212实验药剂注射用甲强龙500MG/瓶4瓶，注射用庆大霉素8万U/瓶60瓶，生理盐水若干，5葡萄糖水若干，由复旦大学附属中山医院药剂科提供。石蜡，二甲苯I溶液，二甲苯II溶液，100乙醇，95乙醇，80乙醇，75乙醇，苏木精染液，伊红染液，1盐酸，1氨水，中性树脂，二甲苯石碳酸，由复旦大学上海医学院病理教研中心提供。分析纯大肠杆菌内毒素1MG，EDTA10中性甲醛脱钙液400ML，5福尔马林缓冲固定液500ML，由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。液氮，反应缓冲液，TAQDNA聚合酶，4DTNP，引物U6、MIR2103PRAT，引物GAPDH（RAT）、NOTCH1、HES1、RBPJ，004MOL/LTRIS乙酸，0001MOL/LEDTA，10MG/L，无菌水，溴化乙锭溶液由上海捷易生物科技有限公司提供。213实验仪器病理切片机（REICHERTHISTOSTATROTARYMIRCOTOME820）FUNGLYNFTC3000实时荧光定量PCR仪（加拿大枫岭生物）；核酸蛋白测定仪（BIOTECH）；微量高速离心机（OHAUS）；米欧微孔板离心机（MINIP2500）；MIX3000混匀小精灵（杭州米欧仪器有限公司）；海尔冰箱（中国海尔）；EPPENDORFRESEARCHPLUS（德国艾本德公司）单孔枪，量程包含25UL、10UL、200UL、1ML；奥豪斯（OHAUS）的单孔枪，量程包含25UL、10UL、20UL、200UL、1ML；电动单道移液器（THERMO）；EPPENDORF5415D离心机；研钵；22实验方法221激素性骨坏死模型建立SD大鼠常规适应性饲养一周，实验组腹腔注射大肠杆菌内毒素10G/KG体重一次；对照组腹腔注射等量生理盐水。腹腔注射完成后24H，实验组臀肌注射甲强龙40MG/KG体重3次，每天1次，两次间隔24H；对照组每次臀肌注射等量5葡萄糖水。甲强龙肌注完成后24H，实验组腹腔注射庆大霉素8万U一次，对照组腹腔注射等量生理盐水。222大鼠股骨头标本取材骨坏死模型建立完毕后，常规饲养。在4周（记为A组）、8周（记为B组）和12周（记为C组）的时候将实验组与对照组的大鼠各以颈椎脱位法处死10只，每次处死20只大鼠。切开双侧髋关节囊，用医用剪刀于股骨头下方23MM处切断股骨颈，获得大鼠双侧股骨头标本，一侧标本使用5福尔马林缓冲固定液固定，用于HE染色切片的制作；另一侧标本放置于冻存管中与80冻存，用于MIRNA210和NOTCH信号通路表达的检测。223HE染色切片制作（1）取下的大鼠股骨头标本浸泡于5福尔马林缓冲固定液中固定48小时后取出，在流水下冲洗至无福尔马林残留。（2）将股骨头标本至于EDTA10中性甲醛脱钙液中脱钙，每48小时更换一次脱钙液，共脱钙至大头针可以轻松穿入股骨头。（3）将股骨头标本从脱钙液中取出，在流水下冲洗至无EDTA脱钙液残留，常规石蜡包埋，用切片机4M切片。（4）用二甲苯I和二甲苯II依次浸泡10MIN脱蜡，然后100、95、80和75浓度的乙醇依次浸泡5MIN洗脱二甲苯，最后用蒸馏水清洗35MIN取出，用吸水纸将蒸馏水吸干。（5）将切片放入苏木精染液中染色5MIN，取出，流水洗去多余染液。（6）1盐酸乙醇分化3S，流水冲洗约30S。（7）1稀氨水反蓝30S，取出，流水冲洗10MIN，再用蒸馏水过洗3S。（8）将切片放入酒精伊红染液中染色3MIN，取出，用蒸馏水洗去多余染液。（9）再脱水依次用80、95、95、100、100乙醇浸泡5MIN脱水。（10）透明化依次用二甲苯石碳酸（31）、二甲苯I和二甲苯II浸泡5MIN。（11）中性树脂封片，光镜下观察切片。224信号通路表达检测QPCR检测方法（1）RNA抽提I、大鼠股骨头样本的处理。（1）将干净的研钵和杵用液氮预冷，大鼠股骨样本用液氮预冷。（2）将大鼠股骨样本置于研钵中，加液氮没过样本。用杵轻捣样本，至样本碎裂，研磨成粉末。过程中不断补充液氮，始终没过样本。（3）将样本粉末转移至预先加过1MLTRIREAGENT的15ML离心管中，混匀，20过夜。II、处理好的大鼠股骨样本，用ZYMORESEARCH的DIRECTZOLRNAMINIPREP试剂盒进行抽提RNA。操作中离心步骤的离心速度可以为10,00016,000XG。（1）将样本TRIREAGENT的混合液从20取出，室温放置10MIN。（2）混合液12,000XG离心1MIN，将上清转移到去RNA酶的离心管中；（3）在处理过的样品中加入相同体积的乙醇95100（11），涡旋混匀，将混合液加到ZYMOSPINIICCOLUMN，然后放到收集管上，离心1MIN，转移柱子到新的收集管上，丢弃原来的收集管；（4）在ZYMOSPINIICCOLUMN中加入400UL的RNA预洗脱液（DIRECTZOLRNAPREWASH），离心1MIN，丢弃收集管中液体，重复这个步骤，在柱中加入700UL的RNA洗脱液（RNAWASHBUFFER），离心1MIN，丢弃收集管中液体，为了确保完全的清除洗脱液，将柱子再离心2MIN。仔细的将柱子转移到去RNA酶的离心管上；（5）在柱子中直接加入30UL的DNASE/RNASEFREEWATER，最大离心速度离心1MIN，纯化的RNA可以立即使用或者储存在70。（二）引物设计引物共计8种13个（由上海捷易生物科技有限公司委托设计，见下表格），先将引物干粉离心数秒，按照说明加入适量RNASEFREEH2O，引物工作液浓度10M；GENENAMEPRIMERSEQUENCE5TO3AMPLICONSIZEBPU6FCTCGCTTCGGCAGCACAU6RAACGCTTCACGAATTTGCGT95RNOMIR2103PRTGAGTAGACCAATGGGTTCATTTCTGGGTCTTATTCTATTCCATTGGTCTACTCTCAGCCRNOMIR2103PFCGCTGTGCGTGTGACAGCRNOMIR2103PRTGGGTTCATTTCTGGGTCTT66注U6RT引物就为反向定量引物。（三）PCR步骤方法（1）、将RNA模板和5ALLINONERTMASTERMIX放置于冰上；（2）、在冰上准备反应液RT组分加入体积（UL）5ALLINONERTMASTERMIX4RNATEMPLATEVARIABLENUCLEASEFREEH2OUPTO20（3）、反应液混合均匀，短暂离心后，25孵育10MIN；（4）、42逆转录50MIN；（5）、85灭活逆转录酶5MIN，得到的CDNA于20保存，使用时稀释到工作浓度10NG/UL。（6）PCR体系20LPCR反应组分每个体系加入量LKAPASYBRFASTQPCRMASTERMIX210上游引物FP（10UM）04下游引物RP（10UM）04CDNA10NG/L2RNASEFREEH2O72（7）PCR反应程序TEMPERATURETIMECYCLE95PREDEGENERATION3MIN195（DENATURE）5S40GENENAMEPRIMERSEQUENCE5TO3AMPLICONSIZEBPGAPDHFACTTTGGCATCGTGGAAGGGGAPDHRTGCAGGGATGATGTTCTGGG128NOTCH1FGCTTGCAGTAGCAAGGAAGCNOTCH1RGCATGCTTGAGCTGTCCAAC91HES1FGCACAGAAAGTCATCAAAGCCTHES1RTGCCGGGAGCTATCTTTCTT117RBPJFCACTCCCAAGACTGATAATTAGGAARBPJRGGACATGGAGTGGCCTGAAA16960（PRIMERANNEALING，EXTENSION）20S7230S9490S603MINMELTING（熔解曲线）9410S1（8）配制2的AGAROSE凝胶取06GAGAROSE放入三角烧瓶中，加入30MLTAE溶液，微波炉中加热至完全溶解，冷却至50时加入溴化乙锭溶液（10MG/ML）15ML，终浓度为05G/ML。浇板，水平放置，带冷却至室温（约30MIN）。（9）上样电泳取10LPCR样品上样电泳，另取1LPEGM3ZFHAEIIIMARKERS05G/L作为DNA片段大小对照。75V电压下电泳，紫外灯下观察条带分布。23数据处理本实验数据采用SPSS数据处理软件处理，计算各个数据的95可信区间以及同组数据之间的T检验P值、R值。其中P值以005作为有统计学意义，R值以08作为有统计学意义。结果31大体标本最终大鼠死亡三只，取得股骨头标本572114个。取得的股骨头大体标本如图311及312所示，所有的股骨头标本形态均较为规整，未见明显的塌陷发生。图311手术区大鼠股骨头标本。在髋部切开肌肉和关节囊，红圈处即为大鼠股骨头。图312取下的大鼠股骨头标本。箭头所指为切断的股骨头韧带（圆韧带）。32HE切片结果321A组（4周）结果实验组与对照组切片中均未见明显骨坏死表现，3个随机视野中空骨陷凹率均50，可认为实验组与对照组均未发生骨坏死。图321A和B分别为对照组在低倍镜和高倍镜下的视野，可见骨陷凹中基本都有骨细胞填充，骨小梁结构正常。C和D分别为实验组在低倍镜和高倍镜下的视野，可见结果与对照组相似，偶尔可见散在的空骨陷凹（箭头所示），没有实际意义。322B组（8周）结果对照组结果与A组相似，3个随机视野中空骨陷凹率均50，可认为对照组组未发生骨坏死；实验组多个视野中均可见骨细胞缺失，空骨陷凹率50，可认为实验组有较为明显的骨坏死发生。图322A和B分别为对照组在低倍镜和高倍镜下的视野，可见骨陷凹中基本都有骨细胞填充，骨小梁结构正常。C和D分别为实验组在低倍镜和高倍镜下的视野，可见视野中骨细胞大片缺失，存在大量空骨陷凹（箭头所示），散在的和聚集成团的均可见，骨小梁结构不良。323C组（12周）结果对照组结果与A组相似，3个随机视野中空骨陷凹率均50，可认为对照组组未发生骨坏死；实验组实验组多个视野中均可见骨细胞缺失，空骨陷凹率50，但发生率较B组的实验组低，可认为实验组有骨坏死发生率较B组低，或已经进入骨坏死后期修复过程。图323A和B分别为对照组在低倍镜和高倍镜下的视野，可见骨陷凹中基本都有骨细胞填充，骨小梁结构正常。C和D分别为实验组在低倍镜和高倍镜下的视野，可见多数骨陷凹中存在骨细胞填充，但也有少数聚集成团的空骨陷凹存在（箭头所示），空骨陷凹率相比图322中明显减少。33NOTCH1受体染色切片结果331A组（4周）结果实验组与对照组切片中均未见到明显的NOTCH1染色团块，可认为实验组与对照组中NOTCH1受体均没有明显的表达。图331A和B分别为对照组的阴性染色区和阳性染色区，可见阳性染色多位于软骨下骨区域，呈散在分布（箭头所示）。C和D为实验组的阴性染色区和阳性染色区，可见染色与对照组相近，并无明显差异。332B组（8周）结果实验组与对照组切片中均与A组相似，未见到明显的NOTCH1染色团块，可认为实验组与对照组中NOTCH1受体均没有明显的表达。图332A和B分别为对照组的阴性染色区和阳性染色区，可见阳性染色多位于软骨下骨区域，呈散在分布（箭头所示）。C和D为实验组的阴性染色区和阳性染色区，可见染色与对照组相近，并无明显差异。333C组（12周）结果对照组与A组相似，未见到明显的NOTCH1染色团块，可认为对照组中NOTCH1受体没有明显的表达；实验组中可见较为明显的NOTCH1染色团块，可认为实验组中NOTCH1受体有明显表达。图333A和B分别为对照组的阴性染色区和阳性染色区，可见阳性染色多位于软骨下骨区域，呈散在分布（箭头所示）。C和D为实验组的阴性染色区和阳性染色区，与对照组不同，实验组可见大片成团块状的阳性染色区域（箭头所示），对比度较为明显。34MIRNA210表达检测结果341A组（4周）结果实验组与对照组之间MIRNA210表达量没有统计学差异，P值005。图341本图为A组中实验组和对照组MIRNA210的表达量，T检验P值为0233，大于005，故认为两组之间表达量无统计学差异。342B组（8周）结果实验组与对照组之间MIRNA210表达量有统计学差异，实验组高于对照组，P值005。图342本图为B组中实验组和对照组MIRNA210的表达量，T检验P值为0035，小于005，故认为两组之间表达量有统计学差异。343C组（12周）结果实验组与对照组之间MIRNA210表达量有统计学差异，实验组高于对照组，P值005。图342本图为C组中实验组和对照组MIRNA210的表达量，T检验P值为0020，小于005，故认为两组之间表达量有统计学差异。35NOTCH信号通路表达检测结果351A组（4周）结果实验组与对照组之间NOTCH信号通路表达量没有统计学差异，P值005。图351本图为A组中NOTCH1、HES1和RBPJK的表达量，T检验P值分别为0065、0968和0223，均大于005，故认为两组之间表达量没有统计学差异。352B组（8周）结果实验组与对照组之间NOTCH信号通路表达量没有统计学差异，P值005。图352本图为B组中NOTCH1、HES1和RBPJK的表达量，T检验P值分别为0202、0165和0632，均大于005，故认为两组之间表达量没有统计学差异。353C组（12周）结果实验组与对照组之间NOTCH信号通路表达量有统计学差异，实验组高于对照组，P值005。图353本图为C组中NOTCH1、HES1和RBPJK的表达量，T检验P值分别为0003、0005和0004，均小于005，故认为两组之间表达量有统计学差异。36相关性检测361A组（4周）结果实验组和对照组中MIRNA210表达量和NOTCH信号通路中各个组分表达量无明显相关性（R08）。图361本图为A组中NOTCH1、HES1和RBPJK的表达量与MIRNA210的相关系数，R值分别为0314、0019和0081，均小于08，故认为两者之间不存在线性相关。362B组（8周）结果实验组和对照组中MIRNA210表达量和NOTCH信号通路中各个组分表达量无明显相关性（R08）。图362本图为B组中NOTCH1、HES1和RBPJK的表达量与MIRNA210的相关系数，R值分别为0328、0150和0026，均小于08，故认为两者之间不存在线性相关。363C组（12周）结果对照组中MIRNA210表达量和NOTCH信号通路中各个组分表达量无明显相关性（R08）。实验组中NOTCH1以及HES1的表达量与MIRNA210有明显相关性（R08）；RBPJK的表达量与MIRNA210无明显相关性（R08）。图362本图为B组中NOTCH1、HES1和RBPJK的表达量与MIRNA210的相关系数，R值分别为0851、0879和0645，其中NOTCH1、HES1的R值大于08R，故认为两者之间存在线性相关；RBPJK的R值小于08，故认为两者之间不存在线性相关。讨论激素性骨坏死是骨科临床重要疾病之一，探索骨坏死修复机制无疑能对临床骨坏死的治疗起到至关重要的推动作用。尽管国内外对于骨坏死的修复已经不乏研究，但是对于修复的机制各个研究各执一词，也仍然没有统一的理论能够完整说明修复的病理生理过程。本实验通过LPS加强应急状态后肌注甲强龙建立大鼠激素性骨坏死模型，取不同时间段的股骨头标本检测骨坏死率、MIRNA210及NOTCH通路的表达量，试图明确MIRNA210和NOTCH在骨坏死不同阶段中的表达规律以及它们的表达与骨坏死发生和修复的关系，提供骨坏死修复的一种可能的病理机制。在初期的实验设计中，我们从血管新生相关的MIRNA中筛选了数个与骨坏死的修复机制可能有关联的种类，包括MIRNA92A，MIRNA100，MIRNA210等3233，其中作为低氧应急反应关键调控基因的MIRNA210最终被选为本实验的研究对象。预期结果中，我们认为骨坏死在某种意义上是一个自限性的疾病，其最终结局无非两种自我修复，或者完全坏死导致股骨头塌陷。而在不同时间点取得的股骨头大体标本上，我们均没有发现任一标本发生股骨头塌陷的表现，因此我们预测在本次实验模型的骨坏死晚期中，应该存在修复机制发生着作用，使疾病自限在某一阶段，防止了股骨头塌陷的产生。而从病理切片的HE染色上来看，以通常标准随机三个视野中空骨陷凹率超过50作为骨坏死发生的标志。在实验早期（A组）中，实验组和对照组均没有或极少发现符合标准的样本（见图321），即使偶尔能在实验组中发现个别空的骨陷凹，也并没有什么意义。我们猜想在4周的时间点，骨坏死尚未发生，或者已经发生早期骨坏死但仍然没有产生明显的骨细胞缺失，故而没有观察到足够的空骨陷凹率。而在实验中期（B组），如同预期结果实验组和对照组的HE切片中产生了较为明显的差异，对照组同早期一样未见明显的骨坏死迹象，但实验组中可见到大量的空骨陷凹存在，分布范围较广，散在的空骨陷凹和聚集成块的空骨陷凹均可在切片中发现，骨坏死的现象十分显著（见图322），因此可认为在8周的时候，骨坏死已经明显发生，骨小梁中骨细胞死亡后脱失，产生视野中大量的空骨陷凹，依据以往的经验来看，这个时间点可作为骨坏死的高发阶段，若没有自限性机制，接下来应该会导致所有骨细胞死亡，股骨头失去承重能力而发生塌陷。可是在实验后期（C组）的切片中，我们并没有发现骨坏死有进一步的发展，尽管对照组依旧如同之前的切片一样没有明显的骨坏死迹象，但实验组的切片中我们却没有看见如同8周时一样大量的空骨陷凹（见图323），虽然与对照组对比就可以发现，骨坏死的现象依旧存在，不过空骨陷凹的出现率比起8周的切片中要明显减少，而且值得注意的一点，这些空骨陷凹多为聚集在某一区域的，而并非散在分布，就如同周围的部分重新生成了骨细胞填充骨陷凹，而这一部分还尚未修复一样，为何会产生这样的现象，我们没有在数据库中找到相关的文献，本实验的设计中也没有相应的部分，故而目前未能给出解答，期望在以后的相关实验中能得到响应的结果。综合以上HE切片的结果，对此我们猜测在8至12周的这段时间内，有某种修复机制发挥了作用，抑制的骨细胞的死亡发生，进一步促进了成骨分化，产生了新的骨细胞