从成人肝脏细胞取得的基因组稳定的双潜能干细胞的长期培养

从成人肝脏细胞取得的基因组稳定的双潜能干细胞的长期培养MERITXELLHUCH,1,9,10,HELMUTHGEHART,1,9RUBENVANBOXTEL,1,9KARIENHAMER,1FRANCISBLOKZIJL,1MONIQUEMAVERSTEGEN,2EWAELLIS,7MARTIENVANWENUM,3SABINEAFUCHS,4JOEPDELIGT,1MARCVANDEWETERING,1,8NOBUOSASAKI,1SUSANNEJBOERS,4HANSKEMPERMAN,5JEROENDEJONGE,2JANNMIJZERMANS,2EDWARDESNIEUWENHUIS,4RUURDTJEHOEKSTRA,3STEPHENSTROM,6ROBERTRGVRIES,1,8LUCJWVANDERLAAN,2EDWINCUPPEN,1ANDHANSCLEVERS1,1HUBRECHTINSTITUTEKNAW,UNIVERSITYMEDICALCENTREUTRECHT,CANCERGENOMICSNL,UPPSALALAAN8,3584CTUTRECHT,THENETHERLANDS2DEPARTMENTOFSURGERY,ERASMUSMCUNIVERSITYMEDICALCENTER,POSTBUS2040,3000CAROTTERDAM,THENETHERLANDS3SURGICALLABORATORY,TYTGATINSTITUTEFORLIVERANDINTESTINALRESEARCH,ACADEMICMEDICALCENTER,MEIBERGDREEF9,1105AZAMSTERDAM,THENETHERLANDS4DIVISIONOFPEDIATRICGASTROENTEROLOGY,WILHELMINACHILDRENSHOSPITAL,UNIVERSITYMEDICALCENTERUTRECHT,LUNDLAAN6,3584EAUTRECHT,THENETHERLANDS5DEPARTMENTOFCLINICALCHEMISTRYANDHAEMATOLOGY,UNIVERSITYMEDICALCENTERUTRECHT,LUNDLAAN6,3584EAUTRECHT,THENETHERLANDS6DIVISIONOFPATHOLOGY,DEPARTMENTOFLABORATORYMEDICINE,KAROLINSKAINSTITUTE,ALFREDNOBELSALLE8,F5614186STOCKHOLM,SWEDEN7UNITFORTRANSPLANTATIONSURGERY,DEPARTMENTOFCLINTEC,KAROLINSKAINSTITUTE,KAROLINSKAUNIVERSITYHOSPITALHUDDINGE,HALSOVAGEN,FLEMINGSBERG,SE14186STOCKHOLM,SWEDEN8HUBRECHTORGANOIDTECHNOLOGYHUB,UPPSALALAAN8,3584CT,UTRECHT,THENETHERLANDS9COFIRSTAUTHOR10PRESENTADDRESSWELLCOMETRUST/CANCERRESEARCHUKGURDONINSTITUTE,WELLCOMETRUST/MRCSTEMCELLINSTITUTEANDDEPARTMENTOFPHYSIOLOGY,DEVELOPMENTANDNEUROSCIENCE,UNIVERSITYOFCAMBRIDGE,TENNISCOURTROAD,CB21QNCAMBRIDGE,UKCORRESPONDENCEMHUCHGURDONCAMACUKMH,HCLEVERSHUBRECHTEUHCHTTP/DXDOIORG/101016/JCELL201411050THISISANOPENACCESSARTICLEUNDERTHECCBYLICENSEHTTP/CREATIVECOMMONSORG/LICENSES/BY/30/摘要虽然人的肝脏有着巨大的复制潜能，但是现在仍旧没有一个完整的系统可以在体外维持肝细胞的功能和复制。我们在前面已经证实了单个小鼠的LGR5肝脏干细胞可以在体外扩增分化为上皮类器官，也可以在体内和体外被扩增并分化为功能肝细胞。我们现在描述的是能使这种从人肝脏获得的成人胆管衍生的双潜能祖细胞长期扩增的条件。扩增的细胞在染色体和结构层面高度稳定，碱基改变只有非常低的概率。这些细胞可以非常容易的在体外被转化成功能性肝细胞，并且在体内移植。1抗胰蛋白酶缺乏症和ALAGILLE综合征的病人得来的类器官反映了体内的病理。对初级成人肝脏干细胞的长期无性扩增开辟了疾病模型建立、毒理学研究、再生性药物还有基因疗法等实验的新途径。简介肝脏主要由两种上皮细胞组成肝细胞和导管细胞。肝细胞合成必需的血清蛋白、控制代谢并为各种各样内源性或者外源性的分子解毒。（DUNCANETAL,2009）虽然肝细胞在体内有巨大的复制能力（MICHALOPOULOS,2014），但是它们却抑制体外长期培养。（MITAKA,1998）事实上，一个近期的研究描述了一个人肝脏细胞培养系统，这个培养持续了一周，却只扩增了10倍。（SHANETAL,2013）作为替代品，人胚胎干细胞（HES）和人诱导多能干细胞（HIPS）都曾分化成肝细胞样的细胞。然而，最近的报告结果意味着肝细胞的在引导和重新编排过程中发生了遗传和表观遗传畸变。（LIANGANDZHANG,2013PERA,2011LUNDETAL,2012）这些畸变可能是染色体突变（LAURENTETAL,2011），从头复制的基因拷贝数变异（HUSSEINETAL,2011）和蛋白编码区的点突变（GOREETAL,2011）。这些改变可能会使把它们用作再生性药物的过程变得更加复杂。我们最近研发出了一种培养系统，它可以使成年小鼠单个肠（SATOETAL,2009）、胃（BARKERETAL,2010）、肝脏HUCHETAL,2013B和胰腺（HUCHETAL,2013A）干细胞长期扩增（大于一年）。LGR5是WNT配体RSPONDINS的受体CARMONETAL,2011DELAUETAL,2011，它在这些老鼠的组织中标记了成年干细胞BARKERETAL,2007,2010HUCHETAL,2013A,2013B。这些培养品仍然维持它们自身原有的组织。我们最近采用了这项技术来培养人肠的干细胞（JUNGETAL,2011SATOETAL2011），并且证明了来自患者的肠类器官概括了肠遗传病的病理。BIGORGNEETAL,2014DEKKERSETAL,2013WIEGERINCKETAL,2014这里，我们正在寻求建立一种人肝脏的类器官的培养系统。结果人肝脏干细胞培养的优化我们限定的小鼠肝脏培养基ERFHNICHUCHETAL,2013B只能供人肝脏细胞存活23周（图表1A和1B和图表S1A，顶部，可在线获取）。在小鼠肝脏培养基上的人肝脏培养物的基因表达样本检测出高活性的TGF信号。像CTGF、PLAT、TIMP1和TIMP2这样的TGF靶向基因都高度表达，而TGF络合物（LTBP2和LTBP3）和SMAD4抑制因子（SMURF1和SMURF2）（MASSAGUEETAL,2005）都未有实质性发现。（图像S1B）TGF信号引发生长阻滞还有上皮细胞向间充质细胞的转化（XUETAL,2009）。小分子抑制剂A8301对TGF受体ALK4/5/7的特异性抑制下调了CTGF、TIMP2、PLAT（图表S1C），延长了培养的时间（67周，67次分裂）（图表1B），并且提高了菌落形成的效率（图表1D）。但是培养物最终仍旧退化了（图表1B和1C左侧）。干细胞标记LGR5的表达随时间减少，而像ALB或者CYP3A4这样的分化标记上调了（没有给出数据）。说明我们的实验条件在促进分化。然后我们测试了其他的化合物来引发细胞的增殖和LGR5的表达（表格S1）。增殖的胆管祖细胞在稳态的时候FURUYAMAETAL,2011和受到伤害之后DORRELLETAL,2011HUCHETAL,2013BSHINETAL,2011都出现了。由于FSK这种CAMP通路激动剂在体内会引发胆管细胞的增殖FRANCISETAL,2004，我们不禁提出这样的问题CAMP会促进人肝脏细胞培养吗FSK的加入会上调LGR5和导管标记KRT19，而ALB和CYP3A4会减少（图表S1D）。集落形成效率本质上并没有改变（图表1D），然而培养物扩张后就像正在生长中的经过数月（大于6个月）培养的类器官，它每周分裂比是14到16（图表1B和1C右侧）。相似的情况也在其他CAMP激动剂（8BRCAMP，霍乱毒素或者NKH477）中被观察到（图表S1E）。去掉WNT激动剂RSPO或者通过PORCUPINE抑制（IWP2）阻塞WNT分泌都会导致培养物的快速流失。（图表S1FS1H）这种效果会被外源性增加的WNT所补救。（图表S1H）12个额外的健康人类供体肝脏活检在改良的培养基中培养，用时一致性的翻倍，达到了将近60小时，与培养物的年龄相互独立。（图表1E和1F，表格S2）EDU检测确定了这些细胞在3个月以上的时间内还保持着他们体外增殖的状态。培养物可以非常容易的被冻结和解冻。（没有显示数据）因此，WNT信号，CAMP的激活和TGF的抑制是长期扩增必不可少的因素。来自于导管细胞的类器官供体肝脏的胶原酶灌注使得我们能够取得大量新鲜的、存活的并且还具有功能的人类肝细胞GRAMIGNOLIETAL,2012（图表S2A）我们应用EPCAM来把肝细胞（EPCAM）从导管EPCAM导管细胞中差异性分离。（图表1H,S2B,S2C）SCHMELZERETAL,2007YOONETAL,2011虽然肝细胞没有形成任何类器官，但是EPCAM胆管细胞却以28432的惊人效率发展成类器官。（图表1H,S2D,S2E）粗肝细胞制剂长成类器官结构的效率等同于EPCAM细胞的数量。（图表S2F和S2G）在我们的培养系统里，不是肝细胞，而是导管细胞形成了类器官。克隆的类器官遗传性稳定培养了3个月的类器官保持着正常的染色体数目（图表3A,S4A）。从两个供体那里我们得到了在容器里解离并培养了7天的活检样本。接下来，我们分离了单个细胞并为这两个肝脏来源的细胞建立两个独立的克隆系。（培养物A,培养物B）三个月对这些培养物扩增之后，第二个克隆步骤执行完毕。于是我们可以判定在一个细胞的活体中、分离后和3个月培养中所有基因改变的累积。（图表2A和2B）我们观察到每组培养物中有7201424个碱基替代，其中63139个碱基在3个月的培养里出现。（图表2C）因此，大多数识别出来的碱基替换是在体内（活着的时候）的或者在类器官形成时候出现的，而不是培养时候出现的。这些数字与已经发表了的数据相比怎么样呢IPS细胞与他们的父代体细胞相比，包含10581808个从头合成的碱基替换（取决于通路步骤的第15到25步）。（CHENGETAL,2012）值得注意的是，从这些研究得来的数字不包括在体内的父代体细胞种获得的变异。因此，肝细胞类器官3个月的体外扩增比IPS细胞重新编排少了10倍的碱基替换。在所有的碱基替换数目中，只有一少部分是锁定在蛋白编码DNA上的（每组培养物7到9个碱基替换；图表2D,S3）。除了一个在来自供体2的培养物A上的同义突变（表格S3），在早期克隆培养物中所有的突变都存在了，说明他们不是在3个月的扩增中出现的。这些突变的基因没有一个是出现在COSMIC数据库里的（表格S3）。在IPS细胞里，每个链平均有6个碱基替换影响蛋白编码DNACHENGETAL,2012GOREETAL,2011。接下来，我们在WGS数据中寻找结构变异。我们没有观察到任何染色体畸变（图表3B）。我们在一个肝细胞类器官培养物中观察到两个基因拷贝数变异（CNVS），杂交获得。（图表3C）哎其他的培养物中，我们没有发现任何CNV（图表3D和S4BS4D）。更确切的说，这两个CNVS在早期培养物中就已经存在了，因此它们不是在长期培养中获得的。ES细胞培养物都会表现出变异的染色体组型BAKERETAL,2007，并且IPS细胞能容纳相当大数目的体细胞基因拷贝数变异HUSSEINETAL,2011LAURENTETAL,2011MARTINSTAYLORETAL,2011MAYSHARETAL,2010ABYZOVETAL,2012。在体外和移植后分化成功能性肝细胞干细胞标记PROM1和LGR5，还有导管标记（SOX9，OC2）和肝细胞标记（HNF4A）都非常容易的表达。（图表4A，S5A,S5B）从组织学上讲，肝细胞类器官展示出像导管样的显型，可以表现为（1）单层上皮细胞，表达出细胞角质蛋白标记KRT19和KRT7，或者（2）有无极性的ECADHERINHNF4A和一些KRT7细胞的假复层上皮细胞（图表4B4D）。SOX（图表4E）和EPHB2（图表4F）几乎在所有细胞中都可以被检测到，而LGR5只能在EPHB2的群落里检测到（图表4F）。类器官不能表达像ALBUMIN或者CYP3A4这样的成熟肝细胞的标记（图表4A和5C，EM条）。因此，我们确定了人细胞分化培养基（DM）（表格S1）。去掉生长刺激物RSPO和FSK会导致ALBUMIN和CYP3A4的上调（图表S5C）。之后我们往这个培养基里加入了NOTCH抑制剂DAPTHUCHETAL,2013B，FGF19WUETAL,2011,还有DEXAMETHASONERASHIDETAL,2010FIGURES5D。BMP7据报道会加速肝细胞的体内增殖SUGIMOTOETAL,2007。加入BMP7会稍微促进肝细胞标记ALB和CYP3A4的表达，即使在扩增培养基上（未显示数据）。因此，分化开始57天之前，我们向扩增培养基（EM）里加入了25NG/ML的BMP7（图表5A）。在分化培养基（DM）里培养时，细胞获得明显的肝细胞形态，包括多角形细胞形状（图表5B）。基因表达情况显示出高水平的肝细胞标记（诸如ALB，细胞色素，APOB和补体因子C3）图表5C,5D,S5E。有高水平ALB和MRP4的细胞也被荧光免疫检测法检测出来。（图表5B）相似结果从采自EPCAM的导管细胞的培养物中也能获得。（图表S5F,S5G）免疫组织化学分析表明细胞积累糖原（图表6A）并占用LDL（图表6B）。ALBUMIN被分泌到培养基里（图表6C）。培养物显示出近似CYP3A4的活性就像新鲜的分离出来的肝细胞一样（图表6D，对比图表S2A）。分化的类器官使MIDAZOLAM羟化，这是另一个对功能性CYP3A3/4/5活性的证明。WANDELETAL,1994葡糖醛酸化的羟化MIDAZOLAM，由此显示出I相和II相解毒反应的证据。（图表6E）胆汁酸盐被轻易的分泌到培养基里（图表6F）。最终，这个类器官以和HEPARG细胞相似的水平解毒氨气。（图表6G）在所有的案例中，扩增的人肝脏类器官相比于标准参比细胞HEPG2细胞而言展示出强大的肝脏细胞功能。（图表6）为了测试类器官在体内作为肝细胞移植的能力，我们为有CCL4RETRORSINE的BALB/C裸鼠手术引入急性肝损伤。这个手术需要肝移植。GUOETAL,2002SCHMELZERETAL,2007使用人特异性抗体（图表S6A），我们最初在移植后2小时和2天的时候检测到KRT19阳性的导管样的细胞，分布在整个肝实质。（图表S6B）在随后的时间点上，我们观察到ALB，KRT19人类细胞，单个或者成对的，或者更少的，成更大的肝细胞病灶（图表6H,S6C）。需要注意的是，我们的损伤模型在移植后对移植的扩张没有任何刺激。人白蛋白和1ANTITRYPSIN都在714天内受体小鼠的血清中以高水平被发现，并且在60多天里的六分之五的小鼠和在120多天里五分之二的动物中维持稳定。（图表6I，S6D,S6E）虽然人主肝细胞移植最初产生的人白蛋白含量非常高，（图表6I）但是在一个月内含量就趋近于移植的类器官。病人类器官模型发病机制1ANTITRYPSIN（A1AT）缺乏症是一种遗传病，它使得患者更容易得慢性阻塞性肺病和慢性肝病STOLLERANDABOUSSOUAN,2005。A1AT是从肝脏分泌出来用来从中性粒细胞弹性蛋白酶那保护肺免受蛋白水解损伤。最经常的突变是ZALLELEGLU342LYSOFTHESERPINA1GENE，它会引发肝细胞内A1AT的错误折叠的积累。ZZ突变的表型是血浆中蛋白质减少80，这随后会造成肺气肿STOLLERANDABOUSSOUAN,2005。三个被诊断为A1AT缺乏的病人的活检（表格S2，图表S7A）受到组织学的刻画，RNA和DNA的分离还有培养的扩增。在培养基里，类器官都生长超过4个月，并且表现正常。基因表达分析显示出在DM里细胞分化正常。（图表S7B）功能性测试显示，已经分化了的从A1AT病人得来的细胞分泌高含量的白蛋白，并且像健康的供体来源的类器官培养物一样占据LDL（图表7B7D）。在A1AT缺乏中，肝病的分子学发病机理与肝细胞内质网里蛋白质聚集相关。LAWLESSETAL,2008A1AT蛋白聚集在分化的类器官中非常容易观察，（图表7H）与原始活检中发现的东西相似。（图表7G）A1ATELISA证实了蛋白质分泌减少（图表7）（表格S2说明了每个病人的A1AT分泌），从分化的突变类器官得来的上清液显示出减弱的阻挡弹性蛋白酶活动的活性。（图表7J）蛋白错误折叠是导致PIZZ个体的肝细胞凋亡的主要原因。LAWLESSETAL,2008从A1ATD病人得来的分化的肝细胞类器官酷似体内情况，并且表现出内质网应激，如ELF2的磷酸化（图表7K）和分化状态中增加的凋亡（图表S7C,S7D）。使用ALAGILLE综合征（AGS）病人的活检，我们测试了胆道树的结构缺陷是否也可以用来建模。AGS是缺口信号通路突变导致的，它会导致部分或者全部胆道闭锁。KAMATHETAL,2013病人的类器官在未分化状态是与他们健康的器官是同步的。然而，在分化成单细胞的时候去掉RSPONDIN，NICOTINAMIDE,TGFBI,和FSK，AGS病人类器官不能上调单细胞标记，诸如KRT19和KRT7（图表S7E）。对KRT19的染色显示胆管细胞非常稀少，并且不能整合到上皮细胞中。相反，它们聚成一团，然后在类器官腔中凋亡。（图表S7F）。在AGS老鼠模型中，JAGGED1/NOTCH2在胆道谱系规范中是非必需的，但是在胆道形成过程中是必须的。GEISLERETAL,2008MCCRIGHTETAL,2002因此，AGS肝类器官构成了研究ALAGILLE综合征的第一个3D人类模型系统。讨论肝疾病（从基因遗传疾病到病毒性肝炎、肝癌还有和肥胖相关的脂肪肝）在美国主要死因中排名第十二。HERON,2012不能解决肝病这个问题还要归咎于供体肝的缺乏VILARINHOANDLIFTON,2012，还有我们对于肝病理机制理解的不全面。作为疾病模型或者作为细胞移植治疗来源而培养的任何细胞，评判它们的价值依靠的是它们扩增潜能的保真度和稳健性，也依靠它们保持正常基因和表观遗传状态的能力。PERA,2011HESC分化的可能性还有成纤维细胞（IPS）重新编程为从神经细胞到肝细胞的任何分化的细胞类型，使得包括A1ATD在内的许多人类基因疾病的建模成为可能。RASHIDETAL,2010然而，培养的干细胞遗传的不稳定性引起了人们对于它们是否能在细胞移植治疗中安全使用的担忧。BAYARTANDCOHENHAGUENAUER,2013这里，我们展示的是初代人胆管细胞可以非常容易的在体外扩增为双潜能干细胞从而形成3D的类器官。这些细胞在体外分化成功能性肝脏细胞并且生产移植后的真正的肝脏细胞。体外培养的类器官的遗传稳定性的广泛分析表明，在培养的数个月里，扩增的细胞保持他们遗传完整性。这些结果与我们先前对老鼠的观察相吻合HUCHETAL,2013B，但却与最近出版物中所描述的那种利用多谱系追踪的方法，导管干细胞不能促进老鼠肝细胞重生的说法形成了鲜明的对比。SCHAUBETAL,2014YANGERETAL,2014YANGERETAL,2013。我们的结果就像是斑马鱼和大鼠模型展示的内容一样在肝细胞近乎完全缺失或者增生被阻断的情况下，胆管上皮细胞转化成了肝细胞。CHOIETAL,2014MICHALOPOULOS,2014我们的数据在人类爆发性肝衰竭中被进一步证实。在这种爆发性肝衰竭中有80以上的肝细胞缺失，可以观察到大量增生的EPCAM胆上皮细胞。HATTOUMETAL,2013从A1AT缺乏的患者得来的类器官可以在体外扩增并且模仿体内的病理。相似的，从ALAGILLE综合征患者得来的类器官会重新产生在现在这些患者胆道有的那种的结构性缺陷。用CRISPR/CAS9同源重组的技术进行修复在类器官培养中是可行的，就像我们最近对囊性纤维化患者的结肠干细胞的展示一样。SCHWANKETAL,2013许多单基因遗传病都会影响肝脏，而这些遗传病都应该是服从体外对克隆的肝脏祖细胞进行基因修复途径。总之，我们的结果使人们可以开始使用在体外扩增的人肝脏材料来实验。这种材料是替代供体肝细胞的新的用来研究肝脏重生，肝脏疾病机制，细胞移植疗法，毒理学研究或者毒物测试的肝细胞来源。实验步骤人肝脏类器官培养从供体那里得到肝脏活检051CM3，肝脏外植体是从在ERASMUSMC,ROTTERDAM做的肝脏移植中得到的。ERASMUS医疗中心的医学伦理学会批准了这个材料的研究性使用。我们也已经获得所有病人的知情同意。对于EPCAM分类实验和肝细胞的分离，初代人肝组织的获取是经过知情同意的，也得到了区域伦理委员会KAROLINSKA机构的CLINTEC分部的允许DNR2010/67831/3JORNSETAL,2014。用ACCUTASE胶原蛋白酶消化肝细胞，将它从人肝脏活检（051CM3）中分离出来，就像扩展实验步骤描述的那样。不同的部分是混合到一起的，我们用冷的高级DMEM/F12清洗并在300400转速下离心5分钟。将细胞团与基质胶（BDBIOSCIENCES）或者简化的生长因子BME2（2型基底膜提取物，PATHCLEAR）混合，300010000个细胞接种到48孔板的一个孔里。这用的是无连接的板（GREINER）。在基质胶或者BME凝固之后，加入培养基。培养基是基于ADDMEM/F12INVITROGEN，补充了1的N2，1的B27（都是从GIBCO获得的），125MM乙酰半胱氨酸（SIGMA），10NM的胃泌素，还有生长因子50NG/MLEGFPEPROTECH，10RSPO1条件下的基质（自制），100NG/MLFGF10PEPROTECH，25NG/MLHGFPEPROTECH,10MMNICOTINAMIDESIGMA,5UMA8301TOCRIS,AND10UMFSKTOCRIS为了建立培养，分离后的最初3天，我们向培养基补充了25NG/ML的NOGGINPEPROTECH,30WNTCM（自制，与BARKERETAL2010描述的方法相同），还有10UMY27632,SIGMAALDRICH或者HES细胞克隆恢复液（STEMGENT）。然后，培养基被换成没有NOGGIN,WNT,Y27632,HES细胞克隆恢复液的培养基。在1014天之后，从基质胶或者BME中移出类器官，机械的分割成小片段，并且转移到新鲜的基质中。传代使用1418的分离比，大约每710天一次，持续至少6个月。为了准备冷冻备份，类器官培养物被分离并且与恢复细胞培养冷藏培养基（GIBCO）混合，然后用标准的步骤冻结。需要时，培养物会被用标准步骤解冻，并且像之前描述的那样培养。解冻后的3天里，培养基会加入Y2763210UM生长曲线和扩增比在扩充实验步骤中被具体展示和计算。分离EPCAMCELLS和SINGLECELLCULTURE细胞悬浮液的制备同扩展实验步骤，将它用抗人CD326（EPCAM）染色，在MOFLO分选机DAKOCYTOMATION中分类，之后的4天里，像上面描述的那样补充Y2763210MM,SIGMAALDRICH到培养基后培养。传代是在分裂比为1418，每星期一次。对于细胞增殖实验，单细胞悬液用FSC和脉冲宽度来分类，区分单个细胞。用碘化丙啶染色来标记死亡细胞还有FSC脉冲库宽度门控来排除双峰细胞MOFLOW,DAKO分出来的细胞被种到基质胶和96孔板上，每孔一个细胞。细胞培养如上所述。肝细胞分化和体外功能性研究肝类器官被种下，并在上面所说的肝脏培养基（EM，扩增培养基）中，并且补充了BMP725NG/ML之后，保存710天。然后培养物被分离、接种到相应的补充有BMP7的EM中，存放至少24天。然后，培养基换成分化培养基（DM）ADDMEM/F12培养基补充有1的N2和1的B27，含有EGF50NG/ML,胃泌素10NM,SIGMA,HGF25NG/ML,FGF19100NG/ML,A8301500NM,DAPT10UM,BMP725NG/ML,还有DEXAMETHASONE30UM。分化培养基每1113天换23次。为了评估肝细胞的功能，培养基在上一次更换的24小时后会被采集。功能性研究从采集的上清液或者整个类器官中完成，就像扩展实验步骤中描述的那样。移植我们用了一个GUO等人的修改版的实验报告GUOETAL,2002。简单来说，我们对缺乏BALB/C的雌性裸鼠注射了两针70MG/KGRETRORSINESIGMA，分别是在移植前30和14天。移植前一天，老鼠通过IP注射得到了05ML/KGCCL4还有50MG/ANIMALANTIASIALOGM1WAKOPURECHEMICALINDUSTRIES。另外，动物还接受75UG/MLFK506在饮用水中，直到实验结束肝重生报告成阳性。HEETAL,2010移植当天，老鼠被麻醉，从4个独立供体（P6P10）或者新分离的肝细胞（两个供体）得来的123106个人肝脏类器官细胞悬液被注射到脾脏内。移植的小鼠每周都要注射50MG/ANIMALANTIASIALOGM1WAKOPURECHEMICALINDUSTRIES来消耗NK细胞。为了监测移植状态，我们规律的从尾部静脉抽取血样并用每个人特异性的ELISAASSAYPRO分析当前人白蛋白和人A1ANTITRYPSIN。核型分析和遗传稳定性分析成指数形式增长的类器官培养物在16小时内都被辅以005UG/ML秋水仙碱GIBCO。然后，培养物被TRYPLEEXPRESSGIBCO分成单个细胞，并进行标准的核型分析。用来进行WGS分析的DNA文库是用标准方法从1UG的遗传DNA中产生的ILLUMINA。作为参考样本，不同供体的肝活检被排成统一的深度。序列读数、基因拷贝数变异的调用还有碱基替换的分析都在扩展实验步骤中被具体描述。整个的基因序列的数据被存放在EMBL欧洲核苷酸档案中，编号ERP005929。免疫组织化学，免疫荧光和图像分析组织和类器官被分别固定在甲醛或者4的PFA中，并像扩展实验步骤中描述的那样染色、成像。A1ATD功能实验弹性纤维酶抑制法还有磷酸化的ELF8的检测都如扩展实验步骤中所写。微阵列为了分析人肝培养物的表达，整个RNA都被从肝脏活检或者我们规定的培养基中生长的类器官培养物中分离出来，按厂商说明使用QIAGENRNA酶试剂盒。500NG的RNA被标记出来，只有少部分RNA被输入线性放大盒AGILENTTECHNOLOGIES。通用的人RRNAAGILENT被差异的标记，并与组织或者培养样本杂交。使用4X44KAGILENT整个人类基因基因组双色微阵列G4122F。标记、杂交和冲洗都是按照AGILENT指南操作的。微阵列信号还有背景信息都用FEATUREEXTRACTIONSOFTWAREV953,AGILENTTECHNOLOGIES取得。分层聚群分析在整个肝组织或者类器官实验中被使用。在分层聚群分析中还用到了一个3倍体的切片。数据分析所有值都表示为平均的扫描电镜。我们还使用了人WHITNEY非参数检验。在所有情况下，使用的数据是从至少三个独立的实验中得来的。所有的计算采用SPSS软件包进行。序列号克隆类器官培养物的全部基因序列数据已经被储存到EMBL欧洲核苷酸档案中，序列号ERP005929。本实验的基因表达数据被存到GEO知识库，序列号GSE63859。补充信息补充信息包括扩展实验步骤，7个图表还有5个表格。本文献可以从以下地址找到HTTP/DXDOIORG/101016/JCELL201411050AUTHORCONTRIBUTIONS（省略）REFERENCES（省略）图表1从导管细胞得来的生长的肝类器官3000或10000人初代肝脏细胞被种到48孔板的每个孔里，像说明的那样使用不同的培养条件。（A）实验计划方案（B）老鼠肝脏培养皿ERFHNIC或者补充了A8301A或者A8301和FORSKOLINFSK的培养皿。培养物每隔710天分离，在1418稀释。补充A8301和FSK会显著增加扩增效率。生长大于18代，分裂比是1416每710天，持续大于5个月。实验三份，每条都表示不同的供体。（C）老鼠肝脏培养基中有A8301和有（左）或者没有（右边）FSK类器官的DIC图像，放大率4X（D）群落形成效率百分比在有或者没有A8301和/或FSK。实验三份，来自五个供体。结果被呈现成五个独立实验的平均扫描电镜。（EG）扩增率，体外生长曲线，EDU掺入量在EM里培养的在早期和末期的代的细胞被分析。E和F图片说明了每代细胞每个孔里数到的细胞数从P1P4E,P16P18F。结果被表示成三个独立培养物的平均扫描电镜。数目翻倍的时间被计算出来，就像扩展实验步骤描述的那样。（G）EDU掺入量仍旧在末代中被检测出来。（H）人肝脏细胞悬液被分开到EPCAM导管细胞和更大的EPCAM肝细胞中（如需要确切的选择策略，参见图表S2C）。群体的鉴定结果被白蛋白和KRT19染色确认。分出来的细胞培养了14天。类器官是专门从EPCAM导管细胞中获得的。同样参见图表S1，S2。图表2人类器官在培养中保持遗传学稳定性（A）克隆的培养物是在每个孔中种一个分出来的细胞得到的。DIC图像放大倍率是40X010天,4X20天之前（B）实验装置示意图。2个独立的供体的肝脏活检被培养1周。单个细胞生长成群。得到了两个独立的类器官培养物。在长期的扩增之后，第二步克隆扩增开始实施。作为结果的类器官培养物接受了WGS分析。为了获得所有的体细胞变异，变异体在原始的活检中被过滤。为了决定长期培养对遗传稳定性的影响，体细胞变异被从早期代数的培养物中过滤出去。（C）扇形图说明了每个供体被调查的基因的百分比。右边面板显示的是观察到的碱基替换的总数。说明的是每个培养物体细胞碱基替换的总数，还有被长期诱导培养的数目。（D）左面板说明的是体细胞碱基替换的总数，右面板说明的是影响蛋白编码DNA的因素。参见图表S3。图表3人肝脏类器官的结构性变异（A）代表性的染色体图像类器官培养了16天（P1）和90天（P14）。是正常的染色体数（N46）。在任何分析的样本里（N15）没有主要染色体的异常。具体的染色体数目在图表S4中展示。（B）从活检中（上）和从供体2得来的培养物A中（下）不同的染色体中获得的整个基因组序列数据的读全分析。（C）在培养物A中，对于3号染色体一个区域的拷贝数分析发现了杂合子增益。（D）对两个供体不同类器官培养物的拷贝数分析的总结。从供体2获得的在培养物A的体细胞拷贝数变异被专门观察到，并且已经存在于父代培养物。参见图表S4。图表4人肝脏类器官标记的表达（A和B）用RTPCR（A）和免疫荧光（B）在EM中生长的人肝脏培养物中分析基因表达。基因表达在早期和晚期被分析。人肝脏培养物表达出祖细胞LGR5,SOX9，导管细胞KRT19,SOX9和肝脏细胞HNF4A的标记，但是没有白蛋白标记（ALB）。结果指示成2DCT2DDCT。代表从5个独立供体培养物得来的3个独立实验平均扫描电镜的值。2DDCT被计算出使用持家基因GAPDH作为编码基因。组织，整个肝脏溶解产物。BF共聚焦图像染色ECAD和肝细胞标志HNF4（B）和导管标记（KRT19C，D和SOX9KRT7，E）。原子核HOECHST染色。（F）共聚焦图像染色EPCAM（蓝色）。干细胞标记LGR5（绿色）被限制在WNT靶基因EPHB2（红色）的细胞染色的一个子集里。刻度条，50UMBE还有F,左25UMF,右。参见图表S5。图表5类器官分化成肝细胞人肝脏培养物扩增一个月以上然后被转移到DM里。A实验策略（B和C）肝细胞基因的表达决定于荧光标记（B）或者QPCRC在11天之后。（B）白蛋白的荧光标记ALB,红色还有ZO1绿色。刻度条25UM左；30UM右。C对于白蛋白和细胞色素P4503A4的QPCR分析。图像说明的是三个独立的实验的平均电镜扫描。组织肝脏的整个裂解液。EM与DMP001（E）EM里生长的或者DM里培养11天