关于b基因表达产物与心肌细胞缺血损伤之间的关系及a药物与b基因表达产物相互作用的实验2

本科生实验设计一、实验背景1、心肌缺血基本概述1心肌缺血，是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心脏的供血不是一成不变的，而是始终存在着波动，但这种波动经过机体自身调节，促使血液供需相对恒定，保证心脏正常工作。如果任何一种原因引起心肌缺血，经机体调节不能满足心脏工作需要，这就构成了真正意义上的心肌缺血。其病理病因为血压降低、主动脉供血减少、冠状动脉阻塞，可直接导致心脏供血减少；心瓣膜病、血粘度变化、心肌本身病变也会使心脏供血减少。还有一种情况，心脏供血没有减少，但心脏氧需求量增加了，这是一种相对心肌缺血。临床显示，引起心肌缺血最主要、最常见的病因，是冠状动脉（偶见肺动脉）狭窄。而冠状动脉狭窄的主要原因是动脉粥样硬化。一旦缺血，立刻会引起缺氧。缺氧的直接后果是心肌细胞有氧代谢减弱，产能减小，使心脏活动时必需的能量供应不足，引起心绞痛、心律失常、心功能下降。同时，代谢的废物也不能被有效及时地清除，易产生不利影响。缺血、缺氧、缺能量，最终会影响心脏的收缩功能。2、实验基本事实A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会改变。二、实验目的将通过细胞生物学实验明确以下问题1、B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系2、在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中三、实验原理1、检测B基因的表达产物与缺血之间的关系，即当缺血时，B蛋白的量可能增加或者减少，而且减少的情况可能是缺血使得B基因表达通路受到完全的阻断与破坏；通过利用WESTERNBLOT检测B基因表达产物，借此可以进行B蛋白的定量检测。2、WB基本原理将蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达2。3、关于A药物保护心肌细胞的时候，B蛋白是否参与其中的问题，有两种可能的情况，一是A药物作用的同时，会改变B基因的表达，二是A药物作用和B基因表达并没有因果的关系，可能与该表达产物其他的磷酸化状态的物质有关。在用药物处理之后通过对比可以定量检测B蛋白的表达量，检测方式仍是同上。4、细胞活力的测定CCK8比色法，利用活力测定可以定当B蛋白的含量增加时，作用是结合B基因表达抑制剂的作用，判断B蛋白是保护心肌细胞免受缺血影响还是促进缺血心肌细胞的凋亡。四、实验仪器、试剂和材料1、仪器蛋白质分离所需仪器培养皿、离心管、沸水浴锅等；WB所需仪器电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、硝酸纤维素膜、振荡器、刮棒等。1内容引自HTTP/WWWAHOSPITALCOM/W/2内容引自HTTP/WWWBIOMARTCN/EXPERIMENT/87HTM10012、试剂LOADINGBUFFER等；WB所需试剂盒及其说明书上所需试剂。3、材料H9C2心肌细胞系，B基因的表达抑制剂。五、实验方案1、细胞培养H9C2大鼠心肌细胞系在含有10胎牛血清的高糖DMEM完全培养基内，5CO2、37培养3；缺氧培养的条件是5CO2和95N2、37环境。2、建立实验模型将培养的心肌细胞分别置于20个洁净培养皿中，改用不含胎牛血清的无糖DMEM培养基，前12皿用于目的1的验证，后8皿用于目的2的验证，分别编号120。3、实验1方法A13皿为正常对照组，46皿为表达抑制剂组，79皿是缺氧处理组，1012皿为缺氧处理并表达抑制剂组，各组培养处理2H后取出；组正常对照组13表达抑制剂组46缺氧处理组79缺氧抑制组1012缺氧表达抑制剂B将取出的1、2、4、5、7、8、10、11培养皿（每组2皿重复）中的心肌细胞转移到8个15ML的EP管中，分别加入1ML的裂解液进行裂解，得到裂解细胞悬液；C用沸水煮将EP管中的蛋白质变性，在离心机上12000RPM离心5分钟后取上清分装于新的离心管当中，冰箱内保存；D将上一步获得的上清液进行SDSPAGE电泳、转膜、免疫反应、化学光反应显影；E对比得到的条带宽度，进行实验结果分析；F进行上述步骤的同时，利用3、6、9、12皿进行对应组的细胞活力的测定，加入到CCK8工作液中，一段时间后进行450NM处的比色，记录酶标仪上的OD值。4、实验2方法A1320皿用缺氧条件处理1H，然后分为13、14皿继续缺氧条件处理1H，15、16表达抑制剂条件处理1H，17、18皿缺氧并A药物处理条件1H，19、20皿缺氧并表达抑制剂并A药物处理条件1H；组13、14皿15、16皿17、18皿19、20皿缺氧表达抑制剂A药物B处理完毕后，将取出的培养皿的心肌细胞进行细胞活力的测定，步骤同实验1F，记录OD值；六、实验结果预判及分析1、实验1结果如果5、6皿得到的条带平均窄于1、2皿的条带，说明心肌细胞缺血使B基因表达产物减少；且缺氧处理组和缺氧抑制组的细胞活力差不多，则说明心肌缺血使维持心肌细胞正常生命活动的B基因表达受阻；如果5、6皿得到的条带平均宽于1、2皿的条带，说明心肌细胞缺血使B基因表达产物增加；且缺氧处理组的细胞活力高于缺氧抑制组的，则说明B蛋白的作用是保护心肌细胞免受缺血影响；如果5、6皿得到的条带平均宽于1、2皿的条带，说明心肌细胞缺血使B基因表达产物增加；且缺氧处理组的细胞活力低于缺氧抑制组的，则说明B蛋白的作用是促进缺血心肌细胞的凋亡。2、实验2结果3虞燕萍,周承亮,傅云峰,黄先玫姜黄素对缺血再灌注H9C2心肌细胞凋亡和GSK3表达及其磷酸化的影响J中国中西医结合杂志,2013,332240243如果15、16皿的细胞活力OD值与19、20皿的OD值相近，17、18皿的OD值高于15、16皿和19、20皿，则说明A药物发挥作用必需B蛋白；如果17、18皿的细胞活力OD值高于19、20