中国南方人群β地中海贫血cd4142（cttt）突变的起源与扩散的群体遗传学的研究（可编辑）

中国南方人群地中海贫血CD4142（CTTT）突变的起源与扩散的群体遗传学的研究南方医科大学博士学位论文中国南方人群地中海贫血CD4142（CTTT）突变的起源与扩散的群体遗传学研究姓名蔡望伟申请学位级别博士专业细胞生物学指导教师徐湘民20080515博士学位论文突变的起源与扩散的群体遗传学研究博士研究生蔡望伟指导教师徐湘民教授摘要背景与目的健康危害最大的单基因遗传病之一，其分子遗传学基础是由于13一珠蛋白基因缺陷，导致血红蛋白分子中13一珠蛋白肽链的合成减少或缺如，从而引起血红蛋白的O【D珠蛋白肽链比例失衡，进而导致血红蛋白不稳定、红细胞破坏而产生以溶血性贫血为主的症状群，在临床上表现为轻重不等的慢性进行性溶血性贫血。B一地贫是我国长江以南各省区人群中发生率最高、危害最为严重的遗传病之一，其中尤以广西、广东、海南等地发生率为甚，广西和广东人群携带率分别为48，678和254336，海南人群的携带率估计约为27，而海南黎族人群高达8116。流行病学、遗传学和体外实验研究结果表明，人类P珠蛋白基因是受疟疾选择作用最明显的基因之一。流行病学研究结果显示，P珠蛋白基因常见的变异在非洲、地中海地区、中东、东南亚和中国南方等热带、亚热带地区，与疟疾的流行区域基本一致。细胞学和流行病学研究发现，血红蛋白病HBS、HBC、HBE以及D一地贫的个体和红细胞均具有抵抗疟原虫感染和降低恶性疟严重程度的作用。最近对D一珠蛋白基因簇单核苷酸多态性的连锁不平衡及单体型的分析发现，HBS、HBC和HBE的发生可能是人类进化史上近5000年内独立发生的事件，提示人类B珠蛋白基因变异与疟疾选择作用密切相关。由于疟疾流行区人群中杂合子优势具有保护人类免患疟疾或减缓恶性疟严重程度的作用。因此，这些具有选择优势的基因在疟疾发生地人群中的高频率有利于人类抵抗疟疾感染而得以生存和繁衍。中文摘要6一地贫的基因突变具有高度的异质性，不同种族人群拥有自己一组独特的P一地贫基因突变谱，表现为明显的地域性或群体特异性。到目前为止，在我国南方人群中至少已发现36种D地贫突变类型。其中，常见的突变基因主要有8种，CD26G专AHBE、29A专G和CD43GT突变，分布在我国东南和西南等南方地区的人群中。值得注意的是，我国入群的13一地贫基因突变类型中，C04142CTTT缺失是一种最常见和分布最广泛的突变，在我国南方各省人群中，该突变约占地贫突变的40，而黎族人中6地贫基因突变几乎全为C04142CONVERSION可能是人C1TT突变。我们最近的研究说明基因转换GENE群中CD4142CTTT突变扩散的主要分子机制。对于特定人群来说，常见和广泛分布的突变往往与其历史和种群变迁相关，因此，可以通过遗传病突变来追朔其建立者或祖先，进而阐述人群起源和进化史，这也是目前国际上分子进化研究的前沿课题。壮族是我国人口最多的少数民族，主要聚居在广西壮族自治区的南部和中西部地区，源于古代百越的一支璐越和瓯越，是我国历史上民族的主体很少迁徙的民族之一。黎族被认为是海南的土著民族，其先民也源于骆越，在海南岛至少有3000年以上的历史，与我国南方属汉藏语系的操壮侗语族诸语言的壮族、侗族、水族、傣族、布依族等民族有密切的渊源关系。尽管D珠蛋白基因CD4142CTTT突变是包括壮族和黎族人群在内的我国南方地区人群中最常见的一地贫突变，但是，该突变何时出现在黎族人群迁徙至海南前出现还是迁徙至海南后出现在起源上，黎族、壮族和汉族人群的CD4142CTTT之间有何关系是否与疟疾选择作用存在相关性黎族人群为什么有如此高的携带率到目前为止尚未有确切的分子遗传学依据。本研究根据壮族和黎族密切的历史渊源关系以及黎族在海南有史可证的时代背景，选择在广西和海南当地人群中CD4142CTTT这一最常见的B一地贫突变为对象，通过群体遗传学分析来阐述中国南方人群中这一具有选择优势的致病突变的起源与扩散，并企图解释人群自然选择的分子进化机制。材料与方法1实验设计和样品在海南岛采集2291例黎族人随机样品，在广西地区采集1627例壮族人随机样品，用于当地人群的D一地贫基因频率调查。以随机数方式分别从上述海南2291例黎族人和广西1627例壮族人中选出201例黎族人和II博士学位论文354例壮族人样品，并分别采集海南岛黎族人居住地的200例汉族人随机样品和广西地区壮族人居住地的262例汉族人样品，用于中国南方人群D一地贫CD4142CTTT突变的分子进化研究。血液学参数和血红蛋白A2定量用于筛查样品中的B一地贫携带者，DNA诊断技术用于进行P一地贫携带者突变的分子诊断。经突变分析确诊，并在上述二地的四组样品中排除了其他类型的D一地贫突变样品后，核准用于群体遗传学分析的样品合计907例，分别为海南黎族人201例，海南汉族人200例，广西壮族人280例和广西汉族入226例。此外，我们还采集了8例D一地贫CD4142CTTT纯合子患者样品用于本研究，分别为海南黎族人L例，海南汉族人3例、广西汉族人2例和广东汉族人2例。2方法用盐析法或磁珠法提取外周血白细胞DNA。用全血细胞计数FBC和HBA。含量测定筛查D一地贫携带者；用等位基因特异PCR和反向点杂交诊断KB片4142CTTT突变。用PCR扩增P一珠蛋白全长基因及其周围序列35段，用双向核苷酸序列测定分析D一珠蛋白基因的单核苷酸多态性SNPS。用基因记数方法计算出各个位点的基因型频率和等位基因频率，用C2检验进行基因型概率法检测各个人群之间的各种CD4142CTTT单倍型的频率有无统计学差异。计算各个人群的单核苷酸多态性杂合度，用方差分析比较各个人群单核苷酸多态性杂合度的差异，并计算人群的分化指数，分析各个人群之间D一珠蛋白基因遗传结构的分化情况。用PHASE211软件进行单倍型分析，用Z2检验进行各个人群单倍型频率的比较。用DNASP410进行FOURGAMETE分析，进行13一珠蛋白基因中重组事件以及发生位置的评估。用ALEQUIN301软件计算各个位点之间的两两相对连锁不平衡系数D值、两两相对连锁不平衡相关系数R2值、各个人群D一珠蛋白基因的核苷酸分离位点数0值和任意两序列之间核苷酸差异D值进行分析对象的中性检验，评估SNP之间的平均数兀值，并计算TAJIMAS的两两不平衡关系及与选择作用的关系。用NETWORK4112软件构建样品的单倍型系统树，观察各种单倍型之间的演变关系。参考相关史料来解释和讨论基因突变及其人群起源和进化历史。结果与讨论在海南岛黎族人群随机大样品调查得出的P一地贫CD4142CTTT突变携之间没有统计学差异P005。根据血液学参数和HBA2含量，在1624份广西III中文摘要壮族随机大样品中调查得出O一地贫突变携带率为664。在随机抽取的354份壮和305，在剔除其它B一地贫突变后，最终入选的280例壮族样品和226例汉族本或两组汉族样本之间CD4142C”盯突变携带率没有统计学差异P005。200例海南汉族入检出CD4142C1陌突变携带者2例，未发现其它6一地点，四组人群中的14个多态性位点的基因型均达到HARDYWEINBERG平衡；四其它位点的等位基因频率没有统计学差异。本研究使用这些多态性位点进行单倍型分析。FOURGAMETE分析结果显示，四个人群P一珠蛋白基因中，除了少数位点外，大部分位点均有重组事件发生。单倍型分析显示，四组人群中共发现47种单倍型，其中，海南黎族和广西壮族人群分别存在26种和20种单倍型，海南汉族人群和广西汉族人群中分别存在20种和27种单倍型，频率较高的单倍型为HP3、HPLL、HP30和HP43，这四种单倍型所占的比例为8914。统计学分析表明，频率较高的单倍型HP3、HPLL、HP30和HP43在四组人群中的分布没有显著性差异，存在显著性差异PO05，他们分别由HP3和HP43发生一次突变衍生而成。在单倍型HP20的频率956明显高于其他三组人群的单倍型HP20频率广西壮族272，广西汉族333，海南汉族625PO05。由于黎族人群与壮族人群均起源于骆越，他们的分化时间约在30005000年以前，根据黎族人群CD4142一CTTT突变单倍型遗传结构单一的特点，我们推测我国人群中的CD4142CTTT突变为单一起源，该突变发生在黎族和壮族人群分化之前，型，然后在进化过程中通过基因转换的方式产生HP47。别位点与其它位点的连锁程度比较弱外，其它位点之间呈较强连锁不平衡。结合FOURGAMETE分析的结果，我们在大样本研究中进一步证实了我们新近发现的结果，即基因转换是进化过程中B一珠蛋白基因变异的形成以及CD4142博士学位论文C”盯在人群中播散的主要机制。中性检验显示，四个人群B一珠蛋白基因白基因的常见SNP位点增多。同时，我们还观察到47种单倍型中存在三种主要单倍型，而且这三种单倍型之间的核苷酸差异比较大，表明这些人群的B珠蛋白基因存在两个以上频率较高的等位基因，提示B一珠蛋白基因受到平衡选择的作用。根据史料，其结果可能与疟疾选择作用相关。我们推测D地贫基因CD4142C1阿突变可能首先发生于长期居住在疟疾流行的广西境内、广东西部等地区的骆越群体中，然后由于受到疟疾的选择作用，在人群中达到多态性水平。除了疟疾选择作用外，漂变和人群迁徙也可能是造成目前CD4142C1盯突变分布格局的原因。我们在NETWORK系统树中观察到黎族人群中的绝大部分的起源和结构上的单一性表明，黎族人群的CD4142一CTLI，I突变的发生和分布符合建立者效应。与汉族和壮族比较，黎族人群体较小，而且是一个相对隔离的人群，建立者效应和人口的快速增长可以解释这一致病基因的频率增长，即使该群体中少数始祖所具有的CD4卜42一C，IITT突变基因逐渐达到较高水平。而在海南汉族、广西汉族和广西壮族人群的CD4142CTTT突变的单倍型中，我们没有观察到建立者效应。由于汉族和壮族的群体较大，遗传漂变可能导致CD4142CTTT突变的等位基因频率逐渐降低或变动不大。历史上，我国人群的迁徙主要是自北往南迁，而南方的群体很少往北迁；广西汉族是在不同时期从北方逐渐迁徙到广西的，而壮族基本上没有往北迁徙，汉族与壮族曾发生比较频繁的基因交流。这种基因流的走向可能是形成目前广西汉族和壮族人群中CD4142一CTL盯突变分布格局的重要因素。历史上海南汉族人迁徙到海南晚于黎族人的迁徙，其D一地贫的突变谱、CD4142一C1盯突变的携带率及该突变的单倍型分布与黎族人不同，但与广西、广东地区人群相似，提示海南汉族人群的CD4142C1盯突变可能是随着汉族迁入海南过程中带入海南汉族群体，该突变在汉族人群迁徙至海南之前已经发生，汉族人群与黎族人群之间的基因交流对海南汉族人群的CD4142一C1广R突变的贡献可能较小。遗传漂变可能也是影响海南汉族人群CD4142C1丌突变频率的重要因素。此外，我们还分析了四个人群D一珠蛋白基因单核苷酸多态性的杂合度及分化指数，结果表明P一珠蛋白基因的遗传结构没有分化。V中文摘要结论1根据人群单倍型的特点、LD类型、FOURGAMETE结果以及重组和突变或缺失发生的机率，结合黎族人群与壮族人群的起源和分化的时间以及黎族迁徙史，我们推测中国人群的CD4142CTTT突变可能是单一起源，发生在黎族和壮族人群分化之前，至少已有3000的历史，CD4142CTTT缺失突变单倍型HP20可能是最早出现的单倍型，然后在人群传播过程中，通过基因转换的方式产生HP47。2连锁不平衡和遗传多样性分析结果表明海南汉族、海南黎族、广西汉族和广西壮族人群的B一珠蛋白基因在进化过程中受到平衡选择的作用，可能与疟疾选择作用相关。疟疾选择作用可能是造成我国南方地区人群B一地贫携带率高于北方人群的重要原因之一。3建立者效应可能是黎族人群CD4142CTTT突变携带率增高的重要原因。遗传漂变可能是导致海南汉族、广西汉族和广西壮族人群CD4142一CTTT突变携带率低于黎族人群的原因之一。4人群迁徙也是影响海南汉族、广殛汉族和广西壮族人群CD4142CTTT突变分布的因素之一。广西汉族人群和广西壮族人群之间的CD4142CTTT突变可能是由于两个民族之间基因交流的结果，而海南汉族人群的CD4142一C”RR突变是随着汉族迁入海南带入汉族群体，汉族人群与黎族人群之间基因交流的贡献可能较小。5四个人群的B一珠蛋自基因的遗传结构非常相似，没有发生分化。遗传漂变迁徙基冈重组关键词D一地中海贫血单倍型平衡选择基因转换进化VI博士学位论文OFTHEANDOFTHECODONS4L42POPULATIONGENETICSORIGINSPREADINSOUTHERNCHINESE13ITHALASSEMIACTTTMUTATIONCAUSINGNAMECAIWANGWDSUPERVISORPROFXUXIANGMINABSTRACTANDBACKGROUNDABJEETIVEISONEOFTHEMOSTCOMMONDISEASESOFHUMANS，13THALASSAEMIAMONOGENICHEALTHRESULTSFROMDEFECTIVEOFAGLOBALPROBLEMITPRODUCTIONCONSTITUTINGMAJORMUTATIONSINIMBALANCEDCHAINWHICHARRISESFROM13GLOBINIBGLOBINGENE，CAUSINGANDOFO【ANDCHRONICCHAINS，UNSTABLEHEMOGLOBINHEMOLYTICPRODUCTIONPGLOBINANEMIATHEDISORDERISCOMMONINTHESOUTHOFINVERYCHINA,ESPECIALLYGUANGXI，ANDHAINANTHECARRIERARE480旷678AND254一336FREQUENCIESGUANGDONGBEINANDCARRIERISESTIMATEDTORESPECTIVELYOUANGXIGUANGDONGTHEFREQUENCYCARDERIS81THELIABOUT27INHAINANHAN16INPOPULATIONTHEFREQUENCYINHAINANPOPULATIONANDCELLULARSTUDIESSHOWEDEVIDENCESTHATSTRONGEPIDEMIOLOGICAL，POPULATIONBASEDTOMALARIASELECTIONPREVIOUSSTUDIESHUMANISONEOFTHE13GLOBINGENESSUBJECTSHOWEDTHATTHECOMMONVARIANTSHEMOGLOBINAREINTHEANDHBE1326GIU争LYSAND13THALASSAEMIAWIDESPREADTROPICALSUBTROPICALSUCHASIAANDTHESOUTHOFASREGIONSAFRICA，MEDITERRANEAN，MIDDLEEAST，SOUTHEASTOFMALARIAINTHEISWELLCORRELATEDWITHTHEENDEMICCHINA，WHICHHISTORYCELLULARINDIVIDUALSANDOFANDSTUDIESINDICATEDTHATTHESOMEERYTHROCYTESPOPULATIONBASEDTHEMALARIAANDCONFCRCDRESISTANCETOINVASIONOFHBS，HBC，HBE13THALASSAEMIAANDINCREASEINFROMFORMSOFPROTECTIONLIFETHREATENINGMALARIARECENTLY，PARASITESSTRUCTUREWITLLHBETHATOFASSOCIATEDHBS、HBC，ANDANALYSISHAPLOTYPESUGGESTEDARISEWITHINTHE5000THESEVARIANTSARERECENTANDRELATIVELYMAYPASTYEARS，MALARIASELECTIONINTHETHATTHEVARIANTSAREASSOCIATED、RITILINDICATINGSTRONGLYEVOLUTIONUNDERMALARIAVARIANTSHADRISENINALLELLICHUMANSELECTION，THERAPIDLYWHICHHUMANFROMINVASIONOFDUETOADVANTAGEPROTECTEDFREQUENCYHETEROZYGOTEOFMALARIAANDREDUCEDTHEOFFORMSMALARIASEVERITYLIFETHREATENINGANDAREEACHMUTATIONSCAUSING13THALASSEMIAHIGHLYHERTEROZYGOUSHIGHFREQUENCYDIFFERENTSETSOFMUTATIONSATLEAST36MUTATIONSOFHASPOPULATION13THALASSEMIAINCHINESEOFHAVEBEENIDENTIFIEDWHICH，CD4142一C1M，POPULATION，8ABSTRACTIVS2654C呵，28AG，CDL7AT，CD7172A，CD26GA1LBE，29THEA寸GANDMOSTCOMMONMUTATIONSITISTHATCD43GT,ARENOTEWORTHYCD4ISTHEMOSTANDINTHE142一CTTTMUTATIONISFREQUENTWIDESPREADPOPULATIONSOUTHERNCHINAANDACCOUNTSFORABOUT40OFTHEOFMUTATIONS，WHILE13THALASSEMICMUTATIONSINLIISALMOSTCD413THALASSEMIAPOPULATION142CT广RMUTATIONISCHINASOFMOSTITSINZHUANGLARGESTMINORITYPOPULATION，WITHPOPULATIONLIVINGTHEAUTONOMOUSLESSINTHEISTOBEGUANGXIREGION，WHOMIGRATESHISTORYITTHOUGHTFROMTHELUOYUEANDXILIISCONSIDEREDORIGINATEDOUGROUPSTHEPOPULATIONTOBETHENATIVEINHAINANALSOFROMTHEPOPULATIONISLAND，WHICHORIGINATEDFORATANDLIVEDINHAINANLEAST3000LIHASLUOYUEGROUPYEARSTHEPOPULATIONCLOSETOTHEOFANDWHOSEORIGINPOPULATIONSZHUANG,DONG，SHUI，DAIBUYILANGUAGETOTHEOFHARTTIBETANBELONGSZHUANGDONGLINGUISTICSUBFAMILYFAMILYALTHOUGHTHECD4ISTHEMOSTCOMMONMUTATIONINTHEOF142CTTTMUTATIONPOPULATIONSSOUTHERNTHEANDLIISUNCLEARTHATWHENTHECHINA,INCLUDINGZHUANGPOPULATIONS，ITMUTATIONOCCURREDANDLACKOFEVIDENCEFORTHEANDOFTHEMUTATIONDIDORIGINSPREADBEFOREOFLIITSITTHETOHAINANORAFTERTOHAPPENMIGRATIONPOPULATIONMIGRATIONHAINANWHATISOFTHEMUTATIONINTHETHEANDRELATIONSHIPORIGINAMONGLI，ZHUANGOFHANTHEMUTATIONINSOUTHEMCHINARELATIVETOPOPULATIONSISHIGHREQUENCIESMALARIATHECARDERISINTHELITHANINSELECTIONWHYFREQUENCYHIGHERPOPULATIONOTHERONTHEOFTHELIANDFROMPOPULATIONBASEDORIGINZHUANGPOPULATIONSCOMMONANCESTORSANDTHETRACEABLEOFTHELIINHISTORYPOPULATIONHAINAN，WETHENUCLEOTIDEANDINTOANALYZEDSINGLEPOLYMORPHISMSHAPLOTYPES13GLOBINGENETHECD4REVEALTHEANDOFMUTATIONINSOUTHOFCHINAORIGIN142CTMSPREADMATERIAISANDMETHODSANDFROM2291INDIVIDUALSOF1STUDYDESIGNPOPULATIONSAMPLINGBLOODSAMPLESLIINHAINANAND1627ININDIVIDUALSWEREPOPULATIONGUANGXIZHUANGGUANGXICOLLECTED13FORLIAND54RANDOMLYSCREENING6THALASSEMIA20GUANGXISAMPLES1WERESELECTEDFROM229INDIVIDUALSAND1627ZHUANGGUANGXISAMPLESRAMDOMLYINDIVIDUALSATTHESAMEOF200HAINANHANINDIVIDUALSTIME，BLOODZHUANGSAMPLESAND262HANINDIVIDUALSWERECOLLECTEDFORMOLECULAREVOLUTIONOFGUANGXIANALYSISCD4CARRIERSWERESCREENED142一C呷MUTATION13THALASSEMIABYUSINGANDCONCENTRATIONDNAWEREPARAMETERSHBA2HAEMATOLOGICALANALYSISTECHNIQUESUSEDTOTHALASSEMICMUTATIONSAFTERTHEOFOTHERDIAGNOSEEXCLUDINGSAMPLESANDMUTATIONSTHEUNKNOWNTOTALOF907WERECHOSENFORMUTATIONS，ASAMPLESFINALLYFURTHEROF201HAINANHAINAANALYSIS，INCLUDINGSAMPLESLI，200HAN，280GUANGXIAND226HANINOFZHUANGGUANGXIADDITION，8PTHALASSEMIAPATIENTSHOMOZYGOUS博士学位论文LLICD4WERERECRUITEDFORTHE142C1盯MUTATIONSTUDY,INCLUDINGPATIENT，3HAINANHANAND2PATIENTS，2GUANGXIHANPATIENTSGUANGDONGHANPATIENTSOR2METHODS11LEDNAWASFROMBLOODSALTOUTMETHODLEUKOCYTESBYPREPAREDCARRIERSOFBEADWERESCREENEDMAGNETICPERIPHERALMETHOD13THALASSEMIABYANALYSISBLOODCELLCELLVOLUMEOFREDCONCENTRATION，MEANCELLMCVCOUNTS，HEMOGLOBINANDCONCENTRATIONTHETHALASSEMICMUTATIONSOFALLWEREDETERMINEDHBA2SAMPLESCHAINREVERSEDOTBYALLELICSPECIFICPOLYMERASEREACTIONPCRORBLOTRDBAOFANDTHEWASPCRFOR35KBFRAGMENTFLANKINGREGIONAMPLIFIEDBY13GLOBINGENEWEREALLNUCLEOTIDEOFDETECTEDPOLYMORPHISMS13GLOBINBYSAM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