【硕士论文】五龙鹅mhcⅰ基因克隆、组织表达及分子特性的研究

分类号S852密级UDC青岛农业大学硕士学位论文五龙鹅MHC基因克隆、组织表达及分子特性的研究MOLECULARCLONING,EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONOFWULONGGOOSEMHCCLASSI研究生姓名贾晓晖导师王宝维教授李桢副教授专业预防兽医学研究方向生物技术中国青岛2006年6月MOLECULARCLONING,EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONOFWULONGGOOSEMHCCLASSITHESISSUBMITTEDTOQINGDAOAGRICULTURALUNIVERSITYINFULFILLMENTOFTHEREQUIREMENTFORTHEDEGREEOFMASTEROFAGRONOMYJIAXIAOHUI（DEPARTMENTOFANIMALSCIENCEANDVETERINARY）SUPERVISORPROFWANGBAOWEILIZHENQINGDAO,CHINAJUNE,2006目录中文摘要英文摘要缩略符号文献综述11综述前言12MHC分子结构与作用机理23畜禽MHC的研究概况44MHC与畜禽抗病性关系的研究6研究内容1五龙鹅MHCCLASSCDNA基因克隆及序列分析911试验材料和方法9111实验动物9112质粒和菌株9113主要工具酶及试剂9114试验仪器10115所用溶液及其配制11116五龙鹅MHCCLASSCDNA基因的扩增和测序1312结果与分析18121五龙鹅脾脏TOTALRNA18122五龙鹅MHCCLASSCDNA基因扩增18123扩增条件的优化18124插入片段的转化18125插入片段的检测19126重组质粒的序列测定20127测序结果2013讨论212五龙鹅MHCCLASS基因组DNA克隆及序列分析2321试验材料和方法23211试验材料23212试验方法2322试验结果分析24221五龙鹅MHCCLASS基因组基因的PCR扩增与鉴定24222重组质粒的鉴定25223重组质粒测序结果25224五龙鹅MHCCLASS基因组基因测序结果分析2523讨论263利用REALTIMEPCR对鹅MHCCLASSI基因的检测2831试验材料和方法28311试验材料28312质粒和菌株28313主要工具酶及试剂28314主要仪器29315试验方法30316五龙鹅MHCCLASSI基因逆转录30317五龙鹅MHCCLASSI基因片段的回收31318重组质粒的构建31319REALTINEPCR对表达量的检测3132试验结果分析33321目的基因的PCR扩增检测33322目的基因的标准曲线的制备34323目的基因的REALTINEPCR3533讨论364鹅MHCCLASSI基因的分子特性的分析3941材料与方法39411试验序列39412序列的提交39413核酸序列的基本分析40414鹅MHCCLASSI蛋白质一级序列的基本分析40415鹅MHCCLASSI蛋白质二级结构和功能预测40416鹅MHCCLASSI蛋白质三级结构预测42417同源性分析与系统发育分析4242试验结果与分析43421核酸序列基本分析43422蛋白质一级序列的基本分析44423鹅MHCCLASSI蛋白二级结构和功能预测45424鹅MHCCLASSI蛋白三级结构和功能预测49425同源性分析5043讨论51结论52参考文献53附录58致谢69CONTENTSABSTRACTENGLISHABSTRACTABBREVIATIONKEYTEXTSUMMARY11SUMMARYPREFACE12MOLECULARSTRUCTUREANDMECHANISMOFACTIONOFMHC23GENERALSITUATIONOFMHCINLIVESTOCKANDPOULTRY44RESEARCHOFTHEDISEASERESISTANTOFMHCWITHLIVESTOCKANDPOULTRY61CLONINGANDSEQUENCEDETERMINEOFMHCCLASSCDNAINWULONGGOOSE11MATERIALSANDMETHODS9111EXPERIMENTALANIMAL9112VECTERANDBACTERIALSTRAIN9113TOOLENZYMEANDREAGENT9114EXPERIMENTALINSTRUMENT10115SOLUTIONANDTHEDISPENSEMETHOD11116AMPLIFIEDANDSEQUENCEDETERMINEOFMHCCLASSCDNAINWULONGGOOSE1312RESULTSANDANALYSIS18121THETOTALRNAOFSPLEENINWULONGGOOSE18122AMPLIFIEDOFMHCCLASSCDNAOFWULONGGOOSE18123OPTIMIZEVOFTHEAMPLIFIEDCONDITION18124TRANSFORMOFTHEINSERTSEQUENCE18125DETECTIONOFTHEINSERTSEGMENT19126SEQUENCEDETERMINEOFTHERECOMBINEPLASMID20127RESULTOFTHESEQUENCE2013DISCUSSIONS212CLONINGANDTHESEQUENCEANALYSEOFTHEGENOMEDNAOFMHCCLASSINWULONGGOOSE21MATERIALSANDMETHODS23211EXPERIMENTALMATERIALS23212EXPERIMENTALMETHOD2322RESULTSANDANALYSIS24221AMPLIFIEDANDDETECTIONOFMHCCLASSGENOMEDNAINWULONGGOOSE24222IDENTIFYOFTHERECOMBINEPLASMID25223SEQUENCERESULTOFTHERECOMBINEPLASMID25224ANALYSETHESEQUENCERESULTOFTHEGENOMEDNAINWULONGGOOSE2523DISCUSSIONS263DETECTIONOFTHEGOOSEMHCCLASSIGENEBYTHEREALTIMEPCR31MATERIALSANDMETHODS28311EXPERIMENTALMATERIALS28312PLASMIDVECTERANDBACTERIALSTRAIN28313TOOLENZYMEANDREAGENT28314EXPERIMENTALINSTRUMENT29315METHOD30316REVERSETRANSCRIPTION30317RECOVERYOFTHEREAGENTOFMHCCLASSIINGOOSE31318CONSTRUCTIONOFTHERECOMBINEPLASMID31319IDENTIFYTHETARGETGENEBYTHEREALTIMEPCR3132RESULTSANDANALYSIS33321DETECTIONOFTHETARGETGENE33322STANDARDCURVEOFTHETARGETGENE34323REALTIMEPCROFTHETARGETGENE3533DISCUSSIONS364BIOINFORMATIONANALYZEOFTHEGOOSEMHCCLASSIGENE41MATERIALSANDMETHODS39411EXPERIMENTALSEQUENCE39412SUBMITOFTHESEQUENCE39413BASICANALYZEOFTHENUCLEODACIDSEQUENCE40414PRIMARYSTRUCTUREANALYZEOFGOOSEMHCCLASSIPROTEIN40415SECONDARYSTRUCTUREANALYZEOFGOOSEMHCCLASSIPROTEIN40416TERTIARYSTRUCTUREANALYZEOFGOOSEMHCCLASSIPROTEIN42417HOMOEOLOGYANALYSISANDHISTORICALDEVELOPMENT4242RESULTSANDANALYSIS43421BASICANALYZEOFTHENUCLEODACIDSEQUENCE43422PRIMARYSTRUCTUREANALYZEOFGOOSEMHCCLASSIPROTEIN44423SECONDARYSTRUCTUREANALYZEOFGOOSEMHCCLASSIPROTEIN45424TERTIARYSTRUCTUREANALYZEOFGOOSEMHCCLASSIPROTEIN49425HOMOEOLOGYANALYSISANDHISTORICALDEVELOPMENT5043DISCUSSIONS51ENTIRECONCLUSIONS52REFERRENCES53ADDENDA58ACKNOWLEDGE69五龙鹅MHC基因克隆、组织表达及分子特性的研究摘要主要组织相容性复合体MAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEX,MHC是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的位于染色体上一个遗传区域，广泛存在于所有脊椎动物，具有高度的多态性和保守性。该基因区编码的蛋白通常称为MHC分子或MHC抗原，是移植排斥的主要决定簇。根据结构和功能可将MHC分为I、II、III三类。在结构上I类分子可分成肽结合区、IG样区、跨膜区和胞浆区4个部位。国内外关于鹅免疫方面的研究较少，本试验以我国优良的地方品种五龙鹅为试验对象，主要研究五龙鹅MHCCLASS基因分子特性，获得如下研究结果1根据GENBANK中鸡XM_424372，鼠AY064389，斑马鱼BC066745等的MHCCLASS基因保守序列，使用PRIMERPREMIER50与OLIGO60程序设计一对引物，利用反转录聚合酶链式反应RTPCR从有丝分裂原刀豆蛋白ACONA刺激18H活化的五龙鹅脾细胞中扩增出相应大小的基因，经酶切鉴定和PCR鉴定，将目的片段与PAT2载体连接，转化到DH5感受态中，提取质粒，对序列进行测定，扩增出1062BP的基因，将测得的序列递交到GENBANK中，获得登陆号为AM114925。2根据测得的基因CDNA序列，重新设计引物，提取基因组DNA，利用LAPCR方法从五龙鹅基因组DNA中克隆了MHCCLASSI类分子的基因组序列并分析其基因组结构，经过酶切鉴定和PCR鉴定，获得五龙鹅的基因组MHCCLASSI序列，共有2594BP个碱基，将测得的序列递交到GENBANK中，获得登陆号为AM114924。利用CONTIGEXPRESS生物软件和VECSCREEN程序比较五龙鹅MHCCLASSI的DNA序列和CDNA序列，发现鹅MHCCLASSI含有8个外显子和7个内含子。3用TAQMAN技术建立了一种实时REALTIMEPCR的方法，用于检测鹅MHCCLASSI基因，无菌采取鹅心肝、脾，肺、肾、胸腺、法氏囊、脑、肌肉和胚胎组织，进行实时REALTIMEPCR，该方法具有较好的敏感性和特异性，试验结果发现MHCCLASSI基因在鹅的组织中按不同的表达量关系为法氏囊脾脏胸腺脑肺肌肉肾心肌胚胎肝，通过结果可发现免疫器官中MHCCLASSI基因的表达量要比其它器官的高。4运用生物信息学的方法进一步分析了五龙鹅MHCCLASSI基因核酸序列及氨基酸序列编号WLMHCCLASSI。核酸DNA序列基因酶切图谱分析获得21种常见限制性内切酶的酶切位点；WLMHCCLASSI蛋白分子量为3907469MW，等电点PI为553；蛋白的疏水性为3433，在第300320氨基酸的C端有一段较强的疏水区；有两个蛋白质超家族，有444的可能存在于线粒体内。三维结构中由两个长的螺旋，三个折叠构成，螺旋之间形成一个空间凹陷。与其他16个物种的氨基酸序列多序列比对的进化树，表明鹅MHCCLASSI与鸡有641的同源性，与鼠有435444的同源性，与人的有429同源性。关键词五龙鹅MHCCLASSI分子克隆组织表达生物信息学MOLECULARCLONING,EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONOFWULONGGOOSEMHCCLASSIABSTRACTTHEMAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEXMHCISANEXTENDEDCLUSTEROFGENESWITHEXTRAORDINARYPOLYMORPHISMANDCLOSELINKAGEINTHECHROMOSOMESOFALLVERTEBRATESMHCMOLECULESAREALSOCONSIDEREDASTHEPRIMARYDETERMINANTSINTHETRANSPLANTREJECTIONACCORDINGTOTHEIRSTRUCTURESANDFUNCTIONS,MHCMOLECULESCOULDBEDIVIDEDINTOCLASSI，IIANDIIIMHCCLASSICONSISTSOFPEPTIDEBINDINGREGION,IMMUNOGLOBULINLIKEREGION,TRANSMENBRANEREGIONANDCYTOPLASMICREGIONUNTILNOW,FEWRESULTSABOUTGOOSEMOLECULARIMMUNOLOGYHAVEBEENPUBLISHEDASACHINESEINDIGENOUSBREED，WULONGGOOSEBREEDWASCHOOSEDASMODELANIMALFORSTUDYINGTHEPROPERTIESOFMHCMOLECULES1ACCORDINGTOTHEMRNASEQUENCEOFMHCIMOLECULESOFCHICKENXM_424372,MOUSEAY064389,ZEBRAFISHBC066745REGISTEREDINGENBANK,THEPRIMERPREMIER50ANDOLIGO60WEREADOPTEDTODESIGNAPAIROFPRIMERS,THERTPCRPROCEDUREWASTAKENTOAMPLIFYTHETARGETGENEFROMWULONGGOOSESPLEENCELLSTHATWASSTIMULATEDBYTHECONAAFTERBEINGIDENTIFIEDBYRESTRICTIONANDPCRANALYSIS,THERECOMBINANTPLASMIDSWERELIGATEDTOTHEPAT2ANDTRANSFORMEDINTOTHEDH5COMPETENTCELLS,DISTILLEDANDSEQUENCEDTHETARGETGENEINVOLVED1062BPANDWASSUBMITTEDTOGENBANK（ACCESSIONAM114925）2ACCORDINGTOTHECDNASEQUENCEALREADYDETERMINED,NEWPRIMERSWEREDESIGNED,MHCCLASSIGENEWASCLONEDBYLAPCRMETHODANDANALYZEDWITHRESTRICTIONANDPCRTHERESULTSSHOWEDTHATTHESEQUENCEOFMHCCLASSIOFWULONGGOOSEOBTAINEDWASABOUT2594BPANDHASBEENSUBMITTEDTOGENBANKACCESSIONAM114924INADDITION,THEDNAANDCDNASEQUENCESOFMHCCLASSIOFWULONGGOOSEWERECOMPAREDBYUSINGTHECONTIGEXPRESSSOFTWAREANDTHEVECSCREENPROGRAME,THERESULTSSHOWEDTHAT8EXONSAND7INTRONSWERECONTAINEDINWULONGGOOSEMHCCLASSI3WITHTHETECHNIQUEOFTAQMAN，ANEWMETHODOFREALTIMERTPCRWASDEVELOPEDTODETECTMHCCLASSIGENEOFTHEWULONGGOOSETHEHEART,LIVER,SPLEEN,LUNG,KIDNEY,THYMUSGLAND,BRAIN,MUSCLEANDEMBRYOTISSUESWEREUSEDTOFIXTHEQUANTITYOFPCRTHROUGHFLUORESCENTMETHODWHICHSHOWEDTHEVIRTUESOFBETTERSENSITIVITYANDSPECIALTYTHERESULTSSUGGESTEDTHATTHEORDEROFEXPRESSIONLEVELOFMHCCLASSIGENESINTISSUESLISTEDABOVEWASBURSASPLEENTHYMUSBRAINLUNGMUSCLEKIDNEYHEARTEMBRYOLIVER4DNASEQUENCEANDTHEAMINOACIDSEQUENCEOFMHCCLASSIOFWULONGGOOSEWEREANALYSEDBYTHEMETHODSOFBIOINFORMATIONTHEREARE21COMMONRESTRICTIONSITESTHROUGHNUCLEARACIDDNASEQUENCETHEMELECULARWEIGHTOFWLMHCCLASSIIS3907469MW,PIIS553,THEHYDROPHOBICPROPERTYIS3433,THEREISASTRONGHYDROPHOBICAREAATTHECTERMINATEOF300320AMINOACID,TWOPROTEINSUPERFAMILIESWEREINDICATEDSUBCELLORIENTATIONANALYSISSUGGESTEDTHATTHEPOSSIBILITYOFWLMHCEXISTINGINTHEPLASMIDSIS444THETHEREDIMENSINALSTRUCTUREOFMHCCLASSIOFWULONGGOOSEWASMADEUPWITHTWOLONGHELIX,THREESHEET,ANDASPACIALHOLLOWAMONGTHEHELIXESTHEPHYLOGENETICTREEISFORMEDBASEDONTHESEQUENCEALIGNMENTOFMHCCLASSIOFWULONGGOOSEANDOTHER16SPECIESWHICHSHOWEDTHESIMILARITYBETWEENWULONGGOOSEANDCHICKEN,MICEANDHUMANBEINGWAS641,435444AND429,RESPECTIVELYKEYWORDSWULONGGEESEMHCCLASSIMOLECULARCLONINGEXPRESIONINTISSUESBIOINFORMATICS英文缩写词表英文缩写英文全称中文全称及注释AMPAMPICILLIN氨苄青霉素AMVAVIANMYELOBLASTOSISVIRUS禽成髓细胞瘤病毒BPBASEPAIR碱基对CTTHRESHOLDCYCLE循环数DNADEOXYRIBONUCLEICACID脱氧核糖核酸DNTPDEOXYNUCLEOTIDETRIPHOSPHATE脱氧核苷酸EBETHIDIUMBROMIDE溴化乙锭EXPASYEXPERTPROTEINANALYSISSYSTEMIPTGISOPROPYLDTHILGALACTOSIDE异丙基D硫代半乳糖LBLURIABERTANIMEDIUMLB培养基ODOPTICALDENDITY光密度PBSPHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸缓冲液PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶链式反应REALTIMEPCRREALTIMEPCR荧光实时定量PCRRNASEARIBONUCLEASEA核糖核苷酸酶ARNARIBONUCLEICACID核糖核酸RTPCRREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION反转录聚合酶链氏反应RPMGROUNDPERMINUTE分钟转速XGAL5BROMO4CHLOTO3INDOLYLDGALACTOSIDE5溴4氢3吲哚D半乳糖苷文献综述1综述前言疾病是畜牧业可持续发展畜牧业的大瓶颈，每年数以百计的各种疫病吞噬着大批动物的生命，给畜牧业带来巨大损失。据估计，疾病每年造成的经济损失约占当年畜牧业总产值的1215，由于畜禽生产企业在生产过程中过多地追求经济效益，从而加大了对重要经济性状的选择压力，导致机体抵抗力降低，使疾病发生率逐渐增加1。然而，人们从抗病育种层面上对动物免疫应答以及疾病抵抗力方面的研究却较少，其中很大的原因就在于准确衡量这些性状比较困难2。由于生物本身多样性的缘故，畜禽群体中存在着针对不同疾病的抗性个体，且它们的抗病能力存在着品种间及个体间的差异。这种差异在正常情况下无法进行鉴别，但在疾病直接攻击环境下，可以检测出对某个疾病的真正的抗性，这种检测代价高昂，例如，对育种群，后代或近亲进行攻毒，选择效果应该说是好的，但生产将受到极大影响3。同时，和正常的生产相比，在攻毒环境或疾病环境下所进行的选择，所选择出来的动物与在优良环境下选择的动物在好坏两种环境下所产生的表现并不是一回事，这里面还可能存在与环境互作的基因型，而且假如疾病抗性与生产性能之间存在负相关，那么就会大大增加抗病育种选择的难度，对疾病抗性进行直接选择，很可能因为在其它性状方面数目的增加而引起整个遗传进展的下降4。由此可见，在攻毒环境下对疾病抗性进行选择具有相当难度，一些学者提出将免疫应答作为反映动物机体疾病抗性的间接指标46。他们经过试验发现，一些动物对一系列的抗原，包括鸡红细胞，人血清白蛋白以及传染性牛鼻气管炎病毒IBRV的免疫反应存在遗传变异，这表明对免疫应答的遗传控制的确存在于所有的畜禽品种中79。另外一些人则尝试用别的方法来进行畜禽的抗病能力研究，那就是找出和疾病抗性或真正的基因相关的遗传标记，寻找和这些性状相关的标记基因的工作量非常庞大1012。最近通过分子生物学，基因图谱，免疫等方法，人们逐渐发现针对畜禽的疾病抗性存在着新的机遇，对动物的疾病抗性进行选育越来越具有可操作性。随着分子遗传学和分子生物学以及现代免疫学的发展，主要组织相容性复合体基因被认为与疾病抗性以及免疫应答两者都有紧密相关6,1317。主要组织相容性复合体MAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEX，MHC，是由紧密连锁的高度多态的基因座所组成的染色体上的一个遗传区域，是一个与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族18。其编码产物是免疫系统中极为复杂且具多态性的一类细胞表面转膜蛋白，称为MHC抗原，该抗原主要分布在各种细胞的表面。MHC广泛存在于脊椎动物中，决定着动物的免疫排斥反应，在机体免疫系统中发挥着非常重要的抗原递呈作用，同时也与动物的抗病性和易感性密切相关；目前已证实MHC与畜禽的多种疾病之间存在着强相关，因此近年来成为畜禽抗病育种技术中的重要部分1921。2MHC分子结构与作用机理21MHC分子结构和多态性的研究MHC分子是由一条重链链和一条轻链微球蛋白，2M非共价结合的糖蛋白。链是由MHC所编码，在人类链的相对分子量约为44KDA22，小鼠为47KDA另一条为非MHC编码的P链，在人和小鼠分子量均为12KDA23,24，链含有一条分子量为40KDA的核心多肽和1人类或2小鼠个N连接的寡糖。链由三部分组成，第一部分是伸向细胞外的胞外部分，它占完整多肽的3/4，包括氨基端和寡糖基；第二部分是一段疏水的穿膜多肽；第三部分是由30个氨基酸残基组成的端多肽，存在于胞浆内，链与重链的细胞外部分非共价结合，未直接附着于细胞上。根据许多类分子的一级氨基酸序列和HLAA2及HLAAW68分子的结晶型结构，可把类分子分成4个独立区氨基末端细胞外肽结合区（PEPTIDEBINDINGREGION，细胞外免疫球蛋白IG样区IMMUNOGLOBULINLIKEREGION，穿膜区（MEMBRANEREGION和胞浆区CYTOPLASMICREGION22。211肽结合区PEPTIDEBINDINGREGION肽结合区由两个结构域1和2构成，约含180个氨基酸残基，1与2有很高同源性，但不属于免疫球蛋白超家族成员，在肽结合区含有N连接的寡糖，在1和2区内分别有两个半胱氨酸可形成两个链内的二硫键，从而使1和2区形成两个约含63个氨基酸残基的环状结构，1区的第6080位氨基酸残基和2区第95120位氨基酸残基的组成和排列顺序变化最大，是I类抗原多态性同种异型的分子基础。212免疫球蛋白样区重链的3片段由2片段的羧基末端和插入浆膜段之间的大约90个氨基酸残基组成，该区内的氨基酸序列在所有被检查的类分子中高度保守。序列分析表明它们与IG恒定功能区有同源性，3片段含一IG样二硫键构成的环状结构。根据MHC的突变分析，证明非多态3区含有CD8的结合部位。213跨膜区主链从3片段延伸出一个短的连接区，随后是一个约25个疏水氨基酸组成的片段。这个区域形成一个螺旋，穿过质膜的双脂层疏水区，使MHC的类分子锚定在膜上。和所有己知的跨膜蛋白相同，其疏水序列的羧基末端几个碱性氨基酸，与脂双层内面磷脂相互作用。214胞浆区MHC类链的羧基末端部分含有约30个氨基酸，该区位于胞浆内。在不同MHC类分子中，该区的整个序列是不保守的，但保留一些特异的结构特征。例如，所有类链都含有形成磷酸化的共有的氨基酸序列，这一序列是依赖于蛋白激酶A的CAMP磷酸化位点，也是酪氨酸激酶的保守的磷酸化部位。类分子的羧基末端的第三个保守部位发生内源性磷酸化作用。此外，所有类重链在其羧基末端都含有一个谷氨酰氨残基。这些结构特征的功能意义尚不清楚，可能调节MHC类分子与其他膜蛋白或细胞骨架成分的相互作用。去除羧基端部分可抑制类分子的内化作用，这表明羧基端片段与胞内运输相关。类分子的链由MHC以外的基因编码，在已测定的人的类分子中，链的结构绝对恒定不变。X射线晶体衍射图研究发现，在人的MHC类分子HLAA2的立体结构中，与轻链2M结合的3结构域靠近细胞膜，位于分子的底部1和2结构域远离细胞膜位于分子的顶部，1和2结构域可形成与抗原结合并被T细胞受体TCR识别的空间结构与抗原结合的部位空间构象呈深槽状GROOVE，由1和2结构域各1条螺旋和4条折叠所组成。两条螺旋位于抗原结合部位上部形成两个侧面，4条折叠位于下部形成底面。所构成的深槽可结合810个氨基酸残基，其大小和形状适合于已加工处理的抗原片段。大量重链的氨基酸和核苷酸序列比较表明，几乎所有的多态性残基，或存在于结合槽的螺旋的侧壁或存在于底部的片层上，TCR识别位于深糟外部和表面的氨基酸。对MHC基因产物分析发现，每个MHC分子只有一个肽结合位点；不同等位基因型的MHC分子结合不同结构抗原肽的能力有差异；MHC分子的多态性是通过正向自然选择在每个种系内加以保留而得到的，因此，种系成员能表达结合多种外源性抗原肽的不同等位基因3,22,25。上述发现是近年来分子免疫学领域中杰出的成就之一，为TCR识别MHC与加工处理的抗原复合物的理论研究和某些自身免疫性疾病的发病机理提供了重要依据25,26。22MHC作用机理的研究MHCCLASS在细胞内质网ER中合成并表达于大多数细胞表面。在内质网中含有蛋白酶体，这些蛋白酶体含有多聚蛋白溶解酶亚单位，蛋白酶体将抗原肽降解后与MHC抗原的多肽骨架结合。抗原肽由一种独特的转运蛋白从胞浆转运到内质网中。接着，抗原肽/MHC抗原复合体转运至细胞膜，在这里被CD8T细胞上的TCR识别。CD8分子结合MHC分子抗原结合区以外的其他区域并将抗原肽MHC类复合体紧密地连接于T细胞上，激活T细胞27。无论抗原肽来源于细菌、病毒或自身，只要适合，都可与MHC分子相结合。在未感染的细胞中，发现只有自身抗原结合于MHC分子的抗原结合槽中。如果周围的T细胞能够识别并被激活，这将形成一种潜在的威胁。在正常情况下，T细胞在胞腺发育过程中经阴性选择机制而被排除，或处于“沉默”SILENCED状态，从而避免了自体免疫应答。因此，T细胞主要由外源性抗原激活。如果正常状态遭到破坏，就可引起自身免疫性疾病3,28,29。3畜禽MHC的研究进展1953年，SNELL等最早在小鼠的皮肤移植实验中发现了一个基因，他们认为此基因与组织移植中的排斥反应有关，并首先引入主要组织相容性复合体基因的概念30，也就是说这些免疫现象是受基因控制的，具有遗传特性，后来他们又发现不止一个基因与排斥反应有关，因此称其为主要组织相容性复合体，研究表明脊椎动物的MHC系统具有高度的同源性，此后MHC的发展得到了科学家的广泛关注，陆续在人、哺乳动物、鸟类和鱼类中发现MHC。31牛MHC的研究牛的主要组织相容性复合体又称为BOLABOVINELYMPHOCYTEANTIGEN，位于23号染色体上。1978年，AMORENA等首次报道了牛的MHC类抗原，并将其命名为BOLA，即牛的淋巴细胞抗原31。MHC区只含有一个编码链的基因位点BOLAA。MHC基因被划分为MHC和MHC两个明显的亚区，前者含有DR基因和DQ基因，与BOLAA紧密连锁；后者含有DY、DO、DN、DI、DM、TAPL、LMP2、LMP7等基因。孙东晓报道了瑞士红百花牛和蒙古牛的DR基因含有DRA、DRB1、DRB2和DRB3等四个基因座位，其中DRA为高度表达的基因座位，DRB1为一个不表达的假基因，DRB2的表达量非常低或根本不表达，DRB3是可高度表达的基因座位；DQ基因至少含有DQA1、DQA2、DQBL和DQB2等四个基因位点，均可高度表达32。牛MHC目前已发现37个BOLAA等位基因，1个DRA等位基因，2个DRB1等位基因，1个DRB2等位基因，91个DRB3等位基因，39个DQA等位基因，37个DQB等位基因，1个DIB基因，1个DMA基因，1个DMB基因，3个DYA等位基因。其中DRB3是BOLA中功能最重要的区域，其多态性最丰富，DQ基因次之33。32猪MHC的研究猪的主要组织相容性复合体称为SLASWINELYMPHOCYTEANTIGEN，位于猪的7号染色体34。SLA通过编码方式来控制机体防御抗原的抗体反应，此后LUNNEY和MALLARD等对此给予了证实35。PATRICKCHARDON等人将SLA分为类和类，SLA类至少有A、B、C3个座位，这一区约有615个等位基因其中A基因，含有SLA11、4、2、3、9、5、1，其中SLA1，2及3是功能性基因，分别对应着血清型SLAC，B和A系列；基因，含有SLA6，7，8；IC基因，含有MICL和MIC2，该基因是一种与传统类基因同源的应激诱导型基因，其蛋白是NKG2D受体的配体，它们广泛地存在于各种组织细胞中20。SLA类中有很多基因存在，根据人和猪的MHC物理图比较研究结果可知，在SLA类区已进行物理定位的基因或基因簇从着丝点到端粒有DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、TAP、LMP、DMDP、COLA2、RXRB和KE。但在SLA类基因中仅SLADR和SLADQ在蛋白水平上进行表达，所有的类分子是穿膜杂二聚体，由一条3335KD的链和一条2728KD的链构成36。33羊MHC的研究绵羊的主要组织相容性复合体又称为OLAOVINELYMPHOCYTEANTIGEN，山羊的MHC又称为GLA，与牛相比，迄今在羊MHC基因结构及其多态性方面所做的研究工作还比较少。研究表明，羊的MHC位于第20号染色体上，可分类、类和类，VANDAM等197937第一次发现了山羊的CLASS类抗原。研究表明，羊MHC多态性也是集中在CLASS区的DR和DQ亚区的基因上，目前已发现OLA的至少3个DRA等位基因，3个DRB等位基因，8个DQA1等位基因，16个DQA2等位基因和6个DQB等位基因；有关山羊的报道非常少，目前发现了18个血清学特异的抗原。DEVERSON等（1991）报道OLA和GLA各基因座位之间也存在着连锁不平衡38。MAMILLS等（1996）报道了用PCRRFLP法分析山羊的MHCDRB基因，孙东晓等（1999）报道了哈萨克绵羊的MHCDRB基因位点的多态性39。34家禽MHC的研究家禽主要组织相容性复合体的研究主要集中在鸡上，鸡的主要组织相容性复合体又称为B型复合物40。BRILES等首先是将其作为一种红细胞抗原而发现的。SCHIERMAN发现B血型系统与鸡的MHC有关联41；BLOOM和BACON报道了鸡的MHC位于16号染色体上42。根据MHC分子编码蛋白的类型，把鸡的MHC分子包含三个亚区BFC1ASS、BL（CLASS）、BGC1ASS。高度多态性的BF和BL基因编码典型的MHC分子，鸡有6个MHC位点其中4个位点（BF到BF）定位于B复合物上，其他两个位点（RFP和RFP）则位于鸡基因的RFPY区域。随着生物技术的发展，鸡的MHCBF、BL、BG分别被克隆，其中的BF、BL部分被测序43。对于MHC与抗体之间的关系，DUNNINGTON等证明MHC与抗原的产生有关9；LOUDOVARIS和NINGYANG等报道鸡对SRBC和沙门氏菌的抗体效价与鸡的MHC有关；PINARD等报道抗体对于SRBC的长期应答与鸡MHC等位基因的改变具有相关性44。4MHC与畜禽抗病性关系的研究目前，MHC与疾病相关的机理尚不完全明了，其中分子模拟假说认为某些病原微生物的抗原与MHC抗原分子结构相似，这样可引起机体对这种病原微生物产生交叉免疫耐受，不能产生有效的免疫应答，保护了病原微生物；同时病原微生物刺激机体产生相应的抗体，损伤了具有共同抗原的组织细胞35。受体学说认为MHC抗原作为某种病毒的受体，如小鼠MHC类抗原是乳酸脱氢酶病毒的受体，这种受体与病毒结合。还有人认为MHC是一种免疫应答基因，IR基因通过其产物IA抗原影响巨噬细胞递呈抗原或与其他细胞间相互作用，使机体对某些疾病易感45。另外，还有人认为MHC基因与真正疾病的易感基因连锁不平衡，补体基因缺陷或扩展单体型连锁不平衡从而使MHC与疾病的抗性有关。从70年代末开始，科学家逐渐开始关注MHC与畜禽疾病之间关系的研究，并取得了较大的发展46,47。41反刍动物的MHC与疾病关系的研究反刍动物抗病性的研究主要集中在牛上，在牛BOLA与疾病抗性之间，SOLBU等报道BOLAW16基因与乳房炎的易感性有关48；STEAR等研究了BOLA类抗原与蜱侵染、蠕虫侵染，结果发现BOLAW16CA27特异性位点与较小牛蜱侵染数目减少之间有所联系，而BOLAW6CA2位点与对蜱的易感性有关49。有报道称BOLAA2、A13与口蹄疫抗性有关；BOLAW1和W3对牛白血病有关联。到目前已发现，BOLADQ单倍型与乳房炎易感性显著相关；BOLADRB2A与持续性淋巴细胞增生症PL抗性有关；BOLADRB3223与乳房炎的发病率显著相关，BOLADRB323与胎盘滞留有显著相关，DRB3216和DRB3222与卵巢囊肿显著相关31。有关羊MHC与疾病的报道则相对较少，其中SY1B和SY6在对腐蹄病的抗性和接种后免疫应答中发挥作用，对痒病的抗性也与羊的MHC有关，此外还发现淋巴细胞表面MHC类抗原对蛇形毛圆线虫获得性抗病力之间的关系，还证实了羊MHC与线虫抗生和相关50。42猪的MHC与疾病关系的研究在猪SLA与疾病的抗性方面，ROTHSCHILD等（1984）报道，美国5个猪种对支气管败血波氏杆菌的免疫应答处于SLA控制之下；MALLARD等在NIH小型猪中发现，SLA基因型DD、DG和SS个体对绵羊红细胞、母鸡蛋白溶菌酶和合成肽T，GAL是强应答者；RENARD等发现腹泻造成的断奶前死亡率与SLA的单倍型类型有关；TISSOT等发现遗传性皮肤恶性黑瘤与SLA复合体有关；此外LUNNEY等报道SLA的不同单倍型对寄生虫的抗性也存在类型差异。WARNER和ROTHSCHILD比较完整地列举了SLA与疾病的联系，LUNNEY和BUTLER以及VAIMAN等又对此进行了更新33。43鸡的MHC与疾病关系的研究在鸡MHC与疾病抗性关系方面，研究最多的与马立克氏病MD的关系。现已鉴定出许多与MD抗性相关的基因，如B21、B12单倍型对MD有抗性，而B15、B19单倍型对MD敏感5153。COLLIN等和TAYLOR等（2004）报道了鸡对ROUS肉瘤病RS的抗性与MHC的关系，其中B2单倍型表现出较强的抗性，而B5易感；有些则对RS抗性呈互补性，如B1B1、B3B3对RS易感，而BLB3则表现出较强的抗性，杂合子B23B26也比纯合子B23B23和B26B26有更强的抗性42,5356，还有试验报道了鸡接种沙门氏菌后MHC和MHC基因的多态性，表明了鸡的MHC与沙门氏菌的关联28。经过二十多年的研究表明，牛、羊、猪、鸡等畜禽体内的主要组织相容性复合物与某些疾病的抗性有着密切的关系，但是对于其他畜禽如马、鸭、鹅等的MHC研究却未见报道，另外对于MHC的抗病机理还有待于进一步研究，所掌握的与抗病性状基因连锁的等位基因也较少，缺乏可靠的遗传标记，利用MHC进行抗病育种，不仅在外源基因的选择和分离、基因的导人技术等方面还需进行大量的探索性工作。随着分子生物学和基因工程技术的进一步发展以及抗病育种潜在的巨大经济效应，MHC的研究必将成为21世纪育种的一个热门领域。此次试验以五龙鹅为试验对象。五龙鹅属中国白色鹅种的小型品种，以繁殖性能高而闻名，主要分布于山东省胶东半岛。经过二十多年的品种资源调查、收集，运用家系选育、闭锁选育、BLUP育种技术及分子遗传标记等手段，使五龙鹅体型外貌、生产性能及均匀度整齐一致，具有明显的豁眼特征的白色小型品种，其繁殖性能达到国际领先水平，2002年被农业部确定为国家级保护地方品种。多年来，青岛农业大学优质水禽研究所一直十分重视五龙鹅的基础研究，先后在种质特性、体型指标相关分析、早期血液蛋白（酶）多态性、DNA多型性与体重性状关系、BLUP法估计产蛋性能的遗传趋势、产蛋性能RAPD标记、牧草结构日粮的消化代谢规律、营养水平对生长发育及对基因表达影响、生殖和消化等系统形态学与组织学观察等方面进行了较为全面系统的研究，已取得了显著科研成果。此次研究拓宽了五龙鹅的研究领域，对建立丰富全面的鹅研究平台具有较现实的意义。1五龙鹅MHCCLASSCDNA基因克隆及序列分析11试验材料和方法111试验动物选用青岛农业大学优质水禽研究所育种基地提供的成年五龙鹅健康雄鹅10只。112质粒和菌株1121质粒克隆载体PAT2VECTOR，购自TOYOBO公司，全长2981BP，携带有氨苄青霉素抗性基因AMP和LAC基因，重组体可通过蓝白斑和氨苄抗性双重筛选鉴定，质粒如图11。图11PAT2VECTOR质粒图谱FIG11PAT2VECTORPLASMIDATLAS1122菌株大肠杆菌ECOLIDH5菌株，由潘庆杰教授及董焕声同学惠赠。113主要工具酶及试剂1131总RNA抽提试剂盒CATRIMOX14TMRNAISOLATIONKITVER211购自大连TAKARA宝生物公司CATRIMOX14SOLUTIONLICLSOLUTIONGUANIDINIUMSOLUTION1132反转录试剂盒RNAPCRKIT（AMV）VER30购自大连TAKARA宝生物公司AMVREVERSETRANSCRIPTASEXL（5U/UL）RNASEFREEDH2O10RTBUFFERDNTPMIXTURE（10MMEACH）MGCL2（25MM）1133TAQTM聚合酶LATAQTMWITHGCBUFFER购自大连TAKARA宝生物公司LATAQ5U/UL2GCBUFFER5MMMG2PLUS2GCBUFFERII5MMMG2PLUSDNTPMIXTURE25MMEACH1134DNA纯化试剂盒AGAROSEGELDNAPURIFICATIONKITVER20购自大连TAKARA宝生物公司DRBUFFERDRBUFFERRINSEARINSEBELUTIONBUFFER1135限制性内切酶ECORI酶购自PROMEGA公司。1136DNTP，XGAL，IPTG，DNAMARKERDL2000、DL15000，T4DNA连接酶购自大连TAKARA宝生物公司；溴化乙啶（EB），氨苄青霉素购自华美生物工程公司；胰蛋白胨、酵母提取物均为OXID产品；CONA购自南京生兴生物公司。114试验仪器PCR扩增仪美国MJ核酸蛋白测定仪日本岛津生物仪器公司凝胶成像系统美国UVP低温高速离心机SIGMA公司DY501B型电泳仪北京六一仪器厂H61微型电泳槽上海琪特分析仪器有限公司恒温培养箱SIGMA公司超净工作台苏州净化设备有限公司自动高压蒸汽灭菌器日本SANYO超低温冰箱日本三洋微量移液器EPPENDORF制冰机美国SCOTSMAN恒温水浴锅龙口先科电热恒温培养箱龙口先科恒温水浴振荡器常州国华115所用溶液及其配制，参照分子克隆571151RNA提取用试剂01DEPC水DEPC与去离子水1（V/V）的比例混合，37放置2H轻摇后，121高压灭菌30MIN；75乙醇（V/V）取75ML无水乙醇加01DEPC水定容至100ML，4储存备用。1152琼脂糖凝胶电泳所用溶液溴化乙锭EB储存液100ML去离子水，剧烈搅拌，完全溶解，终浓度为10MG/ML，4避光保存。08琼脂糖凝胶100ML1TAE缓冲液中加入08G琼脂糖，加热至完全溶解稍冷却后，加入适量EB使终浓度为05G/ML。115350TAETRIS乙酸TRIS碱242G冰乙酸571ML05MOL/LEDTAPH8010ML加去离子水定容至100ML，使用时用去离子水作50倍稀释，即为工作液。1154TEBUFFER80TRIS碱121GEDTANA2037G加去离子水800ML，用盐酸调PH值至80，用去离子水定容至1L，高压灭菌。11556上样缓冲液2V/V溴酚兰10ML1V/V蔗糖50ML混匀后，加去离子水定容至100ML，分装，4储存备用。1156CONA将CONA缓慢加入L0MMOL/LHEPES，100MO1/LCAC12溶液PH85）溶解后保存在20。1157大肠杆菌感受态细胞的制备及转化用溶液（CPG）KCL3728GCACL22H2O3676GCH3COOK04907G甘油50ML最终调PH至62，用022M孔径滤膜过滤或高压灭菌。1158氨苄青霉素储存液将1G氨苄青霉素溶解于10ML去离子水中，终浓度100MG/ML，用022M微孔滤膜过滤除菌，分装，20储存备用。1159XGAL50MGXGAL溶于1ML二甲基甲酰胺，终浓度为50MG/ML，分装，20避光保存。11510