磷脂在不同溶剂中的稳定性研究 论文

毕业论文（设计）题目磷脂在不同溶剂中的稳定性研究指导老师专业班级生物技术及应用071姓名学号2010年5月31号摘要本文对磷脂在甲醇、氯仿、氨水按不同比例配制成溶剂中的稳定性进行了研究，为卵磷脂的生产工艺提供参考。研究结果表明，在考察的28天内，三乙胺和氨水的加入使得磷脂含量均随着时间的延长呈现下降的趋势，且三乙胺和氨水的加入量越大，这种变化的趋势越明显。这说明在三乙胺或者氨水存在的有机溶剂中PE和PC是不稳定的。此结果可以为卵磷脂和脑磷脂的制备工艺工业化提供了基础数据。关键词卵磷脂；稳定性；甲醇；氯仿；氨水目录引言11实验材料211原料与试剂212仪器22实验方法221卵磷脂的测定方法222卵磷脂稳定性的测定方法33结果与分析331洗脱液的不同组成对PE含量的影响332洗脱液的不同组成对PC含量的影响433洗脱液的不同组成对未知物质X含量的影响434柱层析流出样品的短期稳定性研究64结论741卵磷脂在三乙胺或氨水中是不稳定的742卵磷脂在储存过程中出现了未知物质743卵磷脂在储存过程中PC和PE稳定性研究8参考文献9引言磷脂普遍存在于动植物细胞的原生质和生物膜中，对生物膜的生理活性和机体的正常代谢有重要的调节功能，同时它具有良好的乳化性和抗氧化性，因而被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。卵磷脂1和脑磷脂是其中两种重要的磷脂，化学名称分别为磷脂酰胆碱（PHOSPHOTIDYLCHOLINE，简称PC）和磷脂酰乙醇胺（PHOSPHATIDYLETHANOLAMINE，简称PE）。高纯度磷脂产品具有无异味、乳化性能强等特点，应用更为广阔，国内外需求量在逐年增加。目前我国鸡蛋主要为食用，加工率低又不便于运输，造成大规模禽蛋饲养地如东三省的鸡蛋供过于求，价格偏低，加上近年来饲料价格上涨，使一些企业出现亏损。每个鸡蛋中大约含有6G磷脂且只存在于卵黄中，总卵黄干物质中至少66的脂肪，因此卵黄被认为是极具潜力的重要磷脂来源。同时卵黄卵磷脂具有高收集率、稳定性好，具有大豆卵磷脂所不具备的一些优点。因此开发出适合我国国情的高纯度蛋黄磷脂2制备方法具有重要的意义。卵磷脂它由极性脂（磷脂、糖脂）、非极性脂（甘油三酸脂、固醇、游离脂肪酸）以及极少量的其它物质组成的复杂混合物36。但由于卵磷脂富含不饱和脂肪酸，易被氧化从而产生一系列过氧化脂质，影响其生理活性。因此，关于卵磷脂稳定性方面的探讨对于提高其品质有重要现实意义。磷脂由于其特殊的结构，使之具有可反应性，主要表现在酯键、脂肪酸和磷脂的X基（即CH2CH2NCH33）上，可发生水解、氧化、羟基化、氢化等反应。卵磷脂含有的不饱和脂肪酸结构使其易于发生自动氧化79。PORTERETAL发现磷脂中不饱和脂肪酸的自动氧化与游离酸或甲酯相似。初始产物是自由基引发形成的二烯氢过氧化物。极谱分析表明链反应产物依次为氢过氧化物、过氧烃类、不饱和脂肪醇（不确定）和醛、酮。ORLOVETAL发现PC被氧化后的荧光光谱类似于氧化的脂肪酸。氧化作用是影响卵磷脂稳定性的主要因素。在卵磷脂的提取和精制等生产过程中需用到丙酮、乙醇等各种有机溶剂，并且各工艺中的各种具体的影响因素（介质、含水量、温度及PH值等）差别较大，因此需要开展工艺条件对PC稳定性影响的研究。目前这一方面的研究报道较少。因此，本实验通过研究不同溶剂中的卵磷脂的稳定性为其生产工艺提供理论指导。1实验材料11原料与试剂卵磷脂粗品（溶剂提取法自制）；蛋黄PC、PE标样（SIGMA公司）；粗提磷脂（实验室自制）；乙腈（色谱纯，MERCK）；甲醇（色谱纯，MERCK）；氯仿（色谱纯，MERCK）；氨水（色谱纯，MERCK）；超纯水。配制下列组成的溶剂（均为体积比）（1）甲醇氯仿80120（2）甲醇氯仿氨水801202（3）甲醇氯仿氨水801205（4）甲醇氯仿氨水8012010（5）甲醇氯仿氨水8012015（6）甲醇氯仿三乙胺801202（7）甲醇氯仿三乙胺801205（8）甲醇氯仿三乙胺8012010（9）甲醇氯仿三乙胺801201512仪器仪器AGILENT1100型高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、UV检测器）；LICHROSORB5SI60色谱柱（46250MM）。棕色、透明钳口密封小瓶（安捷伦科技公司）。2实验方法21卵磷脂的测定方法色谱柱为LICHROSORB5SI60色谱柱10（46250MM）；柱温为室温，检测波长取206NM；流速为10ML/MIN。流动相配比为乙腈甲醇水652510V/V11。采用外标法定量，根据不同组分的峰面积绘制流出曲线，进而对PC、PE进行回收率的估算。22卵磷脂稳定性的测定方法将自制粗磷脂分别溶解在上述溶剂中，配成100MG/ML的溶液。将这些溶液分装好，各装20瓶，密封，在室温下放置在阴凉避光处。隔一段时间各取2个样品进行HPLC分析，做平行对照。通过对各组PC、PE峰面积比较，考察样品中PC、PE含量随时间的变化情况，并取峰面积平均值，作变化曲线12。3结果与分析31洗脱液的不同组成对PE含量的影响洗脱液的不同组成对PE含量的影响见图31、图32。由图31和32可以看出，甲醇氯仿溶剂对PE的稳定性没有影响，这与已有的稳定性研究结果相吻合。当加入一定量的三乙胺和氨水，PE含量随着时间的延长而不断减少。并且随着三乙胺和氨水加入量的增大，这种减少的幅度也逐步增大。这表明，在含有三乙胺和氨水的洗脱体系中，脑磷脂PE是不稳定的，并且三乙胺和氨水越多越不稳定。5000700090001100013000150001700019000210000246810121416182022时间/天PE峰面积溶剂2ML三乙胺5ML三乙胺10ML三乙胺15ML三乙胺图31不同三乙胺加入量的洗脱液中PE含量的变化曲线05000100001500020000250000246810121416182022时间/天PE峰面积溶剂2ML氨水5ML氨水10ML氨水15ML氨水图32不同氨水加入量的洗脱液中PE含量的变化曲线32洗脱液的不同组成对PC含量的影响洗脱液的不同组成对PC含量的影响见图33、图34。由图33和34可以看出，甲醇氯仿溶剂对PC的稳定性没有影响，这与已有的稳定性研究结果相吻合。当加入一定量的三乙胺和氨水，PC含量随着时间的延长而不断减少。并且随着三乙胺和氨水加入量的增大，这种减少的幅度也逐步增大。这表明，在含有三乙胺和氨水的洗脱体系中，卵磷脂PC是不稳定的，并且三乙胺和氨水越多越不稳定。12000140001600018000200002200024000260000246810121416182022时间/天PC峰面积溶剂2ML三乙胺5ML三乙胺10ML三乙胺15ML三乙胺图33不同三乙胺加入量的洗脱液中PC含量的变化曲线0500010000150002000025000300000246810121416182022时间/天PC峰面积溶剂2ML氨水5ML氨水10ML氨水15ML氨水图34不同氨水加入量的洗脱液中PC含量的变化曲线33洗脱液的不同组成对未知物质X含量的影响在稳定性试验中，随着时间的延长，在蛋黄磷脂溶液中出现了一种未知物质X。在HPLC谱图中可以看到它的存在。如图35，在距PE峰不远的右侧有一个小的峰。这个峰在新鲜的粗磷脂溶液，如图36和溶剂的HPLC谱图中都是不存在。它可能是PC或PE的降解产物。MIN024681012141618MAU02505007501000125015001750200018292112233624602757289230953783PE4646X6585PC32991443118995图35第28天时，甲醇氯仿三乙胺8012015的100MG/ML蛋黄磷脂溶液的HPLC谱图图36第0天时，甲醇氯仿三乙胺8012015的100MG/MLMIN024681012141618MAU0250500750100012501500175020001829211223362460275728923095378346466585132991443118995PEPC蛋黄磷脂溶液的HPLC谱图05001000150020002500300035000246810121416182022时间/天X峰面积溶剂2ML三乙胺5ML三乙胺10ML三乙胺15ML三乙胺图37不同三乙胺加入量的洗脱液中未知物质X含量的变化曲线05001000150020002500300035000246810121416182022DAYSX峰面积溶剂2ML氨水5ML氨水10ML氨水15ML氨水图38不同氨水加入量的洗脱液中未知物质X含量的变化曲线该未知产物的含量随着时间的变化没有统一的规律，根据分析，有可能是磷脂与碱反应的产物。34柱层析流出样品的短期稳定性研究在实验过程中，对比较典型的样品（同时含有较多的PC和PE）进行连续跟踪考察，以确定磷脂含量变化的最短时间，并且验证以上的稳定性实验结果。基于以上的磷脂稳定性考察结果，认为含有10ML氨水的洗脱体系变化最为明显，于是选择了配比分别为甲醇氯仿氨水1208010和甲醇氯仿氨水8012010两个洗脱体系的某一样品进行了短期稳定性考察，考察周期分别为85和65小时。120ML甲醇80ML氯仿10ML氨水0500010000150002000025000300000510152025303540455055606570758085时间/小时峰面积PEPCX图39实际样品的短期稳定性考察80ML甲醇120ML氯仿10ML氨水01000020000300004000050000600007000005101520253035404550556065时间/小时峰面积PEPCX图310实际样品的短期稳定性考察从图39、图310的实验结果来看，脑磷脂PE在氨水存在的有机溶剂中是很不稳定的。考察的第一个分析点分别为第14小时和12小时，这时的PE含量就有明显的下降。PC在实验范围内的含量变化很小，说明卵磷脂相比较于脑磷脂稳定一些。未知物质X在实验的第一个分析点就可以检测到，据此我们可以推断，该物质很有可能是PE的反应或者降解产物；这需要进一步的实验研究进行验证。4结论41卵磷脂在三乙胺或氨水中是不稳定的在本实验考察的28天内，三乙胺和氨水的加入使得PC、PE的含量均随着时间的延长呈现下降的趋势，且三乙胺和氨水的加入量越大，这种变化的趋势越明显。这说明在三乙胺或者氨水存在的有机溶剂中PE和PC是不稳定的。42卵磷脂在储存过程中出现了未知物质随着时间的延长，蛋黄磷脂溶液中出现了未知物质X。它可能是在氨水和三乙胺存在的条件下PE的降解或者反应产物。关于未知物质X的产生机理、理化性质以及生理活性等还需要进一步的实验研究。43卵磷脂在储存过程中PC和PE稳定性研究对生产实践具有指导意义对两种柱层析流出液样品的稳定性进行了短期的稳定性研究。发现PE在较短的时间内就会发生含量的明显变化，而PC相比较稳定一些。磷脂在不同组成溶剂中的稳定性研究对接下来的实验以及生产实践具有指导意义。参考文献1陈南羽,封禄田卵磷脂的应用与开发J化学工业与工程技术,1999,20221232李卫,邵友元,黄光斗卵磷脂的提取及热稳定性研究J甘肃化工,2001,271743何新霞,徐丽珊,杨玲大豆磷脂胶丸稳定性的初步考察J中国药学杂志,1999,34,85385404张世宏大豆磷脂湿胶的稳定性研究J武汉工业学院学报,2000,2465黄莉光照条件下粉末磷脂储藏稳定性初探J粮食储藏1997,26529336徐丽珊,何新霞,周虞灿磷脂复合物的稳定性研究J食品科学,2000,21121227周景春,孟冬娅,石富成大豆油、水分和铁对大豆磷脂酸值和碘值的影响J中国生化药物杂志,2001,22290928RENKONENOBREAKDOWNOFLECITHINONALUMINUMOX