神经节苷脂和整合素α2β1对sk-n-sh细胞迁移侵袭的影响（可编辑）

ABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEEFFECTSOFINTEGRINANDENDOGENEOUSGANGLIOSIDESON21INVASIONANDMIGRATIONOFSKNSHNEUROBLASTOMANBCELLSANDTOEXPLORETHERELATIONSHIPOFENDOGENEOUSGANGLIOSIDESANDINTEGRININTHEINVASIONAND21MIGRATIONOFTHESKNSHCELLSMETHODSNBSKNSHCELLLINEWASCULTUREDINTHEMODIFIEDEAGLESMEDIUMWITHORWITHOUTTHEPRESENCEOF10MDTHREO1PHENYL2DECAOLAMINO3MORPHINOLINE1PROPANOL,DPDMP,ANINHIBITOROFGLUCOSYLCERAMIDESYNTHASEINCLINEDTESTANDPOLYCARBONATEFILTERSINCORPORATEDINMODIFIEDTRANSWELLCHAMBERSWEREUSEDTOINVESTIGATEEFFECTSOFMONOCLONALANTIBODIESTOINTEGRIN,INTEGRINANDREPLETIONOF21GD2,THEMAJORENDOGENEOUSGANGLIOSIDESONTHEMIGRATIONANDINVASIONOFTHESKNSHCELLSRESPECTIVELYTHECELLSWERESTAINEDWITHGIMSADYEANDCOUNTEDUNDER200MULTIPLEDMICROSCOPE,CALCULATEDTHEBLOCKINGRATIOSOFINVASIONANDMIGRATIONRESULTSTHEMIGRATIONOFTHESKNSHCELLSWASSIGNIFICANTLYBLOCKEDBYANTIOR2ANTIMONOCLONALANTIBODIESCOMPAREDWITHTHECONTROLCELLSWITHOUTTHE1MONOCLONALANTIBODIES987,THENUMBERSOFCELLSWERE5111AND549RESPECTIVELYP001THEBLOCKINGRATIOOFMIGRATIONWAS480AND449RESPECTIVELYMEANWHILE,THEINVASIONOFTHESKNSHCELLSWASREMARKABLYBLOCKEDBYANTI254ORANTI194MONOCLONALANTIBODIESCOMPAREDWITHTHE21CONTROL425ASWELLP001THEBLOCKINGRATIOOFINVASION405AND548RESPECTIVELYAFTERDEPLETIONOFTHECELLGANGLIOSIDESBYDPDMP,BOTHTHEMIGRATION5512ANDINVASION348OFTHECELLSDECREASEDSIGNIFICANTLYCOMPAREDTOTHECONTROL10912,525P001GANGLIOSIDEGD2WASABLETORECOVERTHECAPABILITIESOFTHEMIGRATION10110ANDINVASION454OFTHESKNSHCELLSEXPOSEDTODPDMP,BUT,THESECAPABILITIESWEREBLOCKEDBYANTIANDANTI21IICONCLUSIONSOURRESULTSSUGGESTEDTHATBOTHINTEGRINANDENDOGENOUS21GANGLIOSIDESOFNEUROBLASTOMACELLPROMOTEINTHEINVASIONANDMIGRATIONOFNEUROBLASTOMACELLSINVITROENDOGENOUSTUMORGLSMAYPLAYANIMPORTANTROLEINTHEMETASTASISOFNEUROBLASTOMABYREGULATINGFUNCTIONOFINTEGRIN21KEYWORDSNEUROBLASTOMAINTEGRINGANGLIOSIDESINVASIONMIGRATION21III目录中文摘要英文摘要目录1前言111NB的发病特点及临床治疗现状112整合素与肿瘤的发生发展213GLS与肿瘤发生发展314课题的研究意义42材料与方法521实验材料MATERIALS522实验方法METHODS73实验结果RESULTS1331整合素对SKNSH细胞迁移侵袭的影响132132GLS对SKNSH细胞迁移侵袭的影响1533GLS与整合素在SKNSH细胞迁移侵袭中的关系17214讨论DISCUSSIONS215结论26参考文献REFERENCES28附录32英文缩略词表39在学期间发表论文清单40致谢41IV暨南大学硕士学位论文1前言11NB的发病特点及治疗现状神经母细胞瘤NEUROBLASTOMA,NB是儿童最常见的颅外神经系统恶性肿瘤,年发病率大约1/10万,其发病率仅次于白血病和中枢神经系统肿瘤。约80神经母细胞瘤患者5岁以下发病,高峰年龄35岁,部分病例有家族史,提示可能与遗传因素有关。NB起源于神经胚胎细胞,可发生于中枢或周围神经,以周围神经多见,发生部位主要见于肾上腺髓质或腹部交感神经节。NB有以下几个临床特点1临床表现呈多样性,给早期临床诊断带来一定的困难,往往容易误诊2肿瘤极易早期发生转移,约70儿童患者在就诊时已发生转移,错过早发现,早治疗的时机3病情进展迅速,疗效不佳,且易复发。目前针对NB治疗多采用手术联合大剂量细胞毒性药物化疗以及放疗综合治疗方案,而且放疗、化疗等治疗手段存在不同程度的副作用但无论采用何种治疗疗效均不理想,统计显示神经母细胞瘤患儿5年生存率尚不足10。NB细胞发病早期转移及治疗后微小病灶转移复发亦一直是困扰医务工作者的一大难题。因此有必要深入探究影响神经母细胞瘤发生、侵袭转移的因素及其作用机制,应用针对肿瘤发生发展机制中某一特异位点的药物,有效地阻断肿瘤的生长、侵袭、转移过程,从而改善NB患儿预后,提高其长期生存率。许多研究提示肿瘤的侵袭和转移是个多种因素、多个步骤、多阶段的瀑布过程,是癌细胞侵犯和破坏周围正常组织,进入循环系统,迁移到特定组织器官并发展为继发性癌灶的过程。肿瘤细胞侵袭转移的第一步就是肿瘤细胞间粘附因子的缺失所致个体细胞从原发肿瘤脱落游离,第二步细胞本身产生多种分解酶,可分解细胞外基质和基底膜,肿瘤细胞侵入循环系统,第三步是循环肿瘤细胞与脉管内皮细胞及细胞外基质细胞的粘附,这些13都是肿瘤转移过程中的关键步骤。事实上肿瘤转移过程无不包含粘附和解离两方面,细胞的粘附、脱粘附和迁移、侵袭是转移的必要过程。肿瘤细胞的转移过程如下图所示1暨南大学硕士学位论文细胞侵袭迁移过程示意图细胞与细胞外基质的粘附是通过受体来实现的,其中以整合素受体占主要比例。整合素作为细胞表面受体扮演细胞信号传导的角色,将接受的信号在细胞内外传递。由于各种肿瘤细胞表面整合素种类不同,而各类整合素在肿瘤生长的各个阶段受外界调节因素不同,表达种类和表达水平也不同,使肿瘤细胞与细胞外基质的粘附处于一种动态的可调节的状态,这对肿瘤细胞的生长和转移有相辅相成的作用。诸多研究表明,不正常表达的整合素在肿瘤的转移过程中具有重要的作用。12整合素与肿瘤的发生发展整合素是一类细胞膜表面糖蛋白受体家族分子,是由和亚基通过非共价键连接构成的二聚体分子。目前发现脊椎动物受体家族包括至少17个亚单位和9个亚单位,共同4组成超过25种不同的整合素,其功能为介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX,ECM之间的相互粘附,双向传导细胞内外与细胞外基质之间分子信号,在多种病理过程中发挥重要作用,如淋巴细胞向炎症部位的聚集及肿瘤细胞的浸润等5调节细胞的增殖、分化、粘附、迁移、侵袭及调亡等过程,在肿瘤进展过程中发挥重要作用。整合素的不正常表达影响肿瘤恶性转化、粘附和转移。恶性转化的肿瘤细胞往往表现在整合素表达质和量的改变,这种改变影响由整合素介导的信号途径所涉及的调节功能,2暨南大学硕士学位论文从而改变肿瘤细胞与相应底物的粘附反应,特异信号的传递或诱导基因表达,直接或间接6调控肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、粘附、侵袭、转移。肿瘤发生发展过程中,有些整合素的出现提示细胞为恶性化增殖,并调节肿瘤细胞侵袭、转移的过程。星形胶质瘤细胞与正常细胞星形胶质细胞相比,前者除和的表达水平提高,还有新表达的、和315V37,表现出对ECM分子亲和力增强,研究证明这种结合是通过整合素介导的。相反,51有些整合素被称之为肿瘤抑制整合素,这些整合素在维持正常的细胞表型中发挥作用。用人整合素的转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,发现可抑制细胞与基质的固定,降低细胞的51增殖,表明整合素在CHO细胞中的过量表达可抑制该类细胞在裸鼠中的成瘤性,而表518达水平下降的CHO细胞成瘤性增加,可见,肿瘤细胞整合素改变可能直接或间接影响肿瘤细胞行为。整合素是细胞与I型胶原蛋白作用的功能性受体,亚基通过I区链接位点特异性识212别氨基酸序列ASPGLYGLUALADGEA选择与胶原蛋白相结合,该序列不被其它整合素910和非整合素胶原蛋白受体所识别,表明该整合素有高度特异的作用目标机制,亚基1可能通过其细胞内片段与细胞骨架连接,参与细胞信号的传导。整合素在多种不同肿21瘤化的细胞株中表达发生改变整合素在胰腺癌细胞中过度表达,抗整合素抗体可21211阻止其与I型胶原蛋白的粘附能力黑色素细胞瘤中整合素的表达远高于原位性黑色2112素瘤,并且这种表达与黑色素瘤的转移性增强呈正相关。这些证据提示整合素与肿21瘤的进展有关。肿瘤细胞的转移是一个粘附、去粘附,迁移、侵袭的连续过程,细胞粘附13能力的改变是细胞转移的重要环节之一,整合素亦在神经母细胞瘤细胞中表达。以21往实验结果显示整合素在神经母细胞瘤细胞SKNSH细胞株中高表达,并在SKNSH2114细胞与胶原蛋白的粘附中发挥重要作用因此有必要进一步探讨整合素与SKNSH21细胞迁移和侵袭的关系。131神经节苷脂GANGLIOSIDES,GLS与肿瘤的发生发展研究表明肿瘤细胞转移能力与以下因素密切相关1细胞表面糖蛋白复合物2细胞膜神经节苷脂含量3细胞表面抗原表达4细胞表面酶活性5细胞转运能15力。我们选择性探讨神经节苷脂对SKNSH细胞侵袭转移的影响。神经节苷脂GANGLIOSIDES,GLS为存在于细胞膜表面含唾液酸的酸性鞘糖脂,该分子嵌于细胞膜的外层,主要见于外胚层起源的组织黑色素细胞、神经母细胞、星形细胞及肺等。位于细胞表面的GLS在正常情况下含量甚微,参与调节胚胎发育,神经生长与修复等生理过程研究发现当细胞恶性转化时,可能激活了包括GLS糖基转化酶在内的许多酶3暨南大学硕士学位论文类,导致其表达的构型和含量发生改变,并脱落进入肿瘤微环境,直接或间接与靶细胞相互作用,在细胞分化、粘附、癌基因转化、调节免疫反应、以及细胞凋亡等方面均起作用,参与肿瘤的生长发展,是肿瘤细胞粘附过程中的候选调节分子。许多研究表明GLS作用于肿瘤形成和进展,在肿瘤发生、肿瘤转移、血管形成、肿瘤免1617疫等诸多方面起着重要的作用肿瘤患者血清中GLS含量增多,并且与肿瘤的恶性程度18成正相关,研究报道肝癌、卵巢癌、NB细胞瘤患者血清中双唾液酸神经节苷脂GD浓度2明显增高,且与还而疾病无进展生存率呈负相关。这些研究表明神经节苷在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。因此,有必要进一步研究GLS在神经母细胞瘤细胞转移过程中所起的作用。132GLS对整合素的调节研究提示神经节苷脂对肿瘤发生、发展的促进作用可能是通过调节整合素功能而实现的。BARLETTA等的研究表明鼠肝癌细胞中神经节苷脂对整合素介导的粘附有调节作用,用19药理方法清除细胞GLS后细胞与细胞外基质的粘附能力下降。神经节苷脂调节整合素受20体的功能在控制神经胶质瘤细胞的粘附和侵袭方面发挥重要的作用。研究表明,神经母21细胞瘤SKNSH细胞株含有高浓度的GLS,并促进NB细胞粘附与胶原蛋白,其作用途径12可能与整合素介导的信号传导有关。因此本研究欲进一步研究GLS是否通过调节整合21素介导的肿瘤细胞对细胞外基质的作用,实现其影响神经母细胞瘤细胞的迁移和侵袭21的功能。14本课题研究的意义整合素介导肿瘤细胞的粘附,侵袭和转移,在肿瘤的生长发展过程中起着重要的作用,同时神经节苷脂可能通过调节整合素的表达及其功能实现对肿瘤发生发展的调节,因此,探究GLS和整合素在神经母细胞瘤的转移和侵袭的关系和作用机制,以及二者之间是否21存在相互的作用关系,可为建立神经母细胞瘤的生物治疗方案提供理论支持。4暨南大学硕士学位论文2材料与方法211实验材料1主要试剂培养基MEMGIBCO公司胎牛血清FBSHYCLONE公司丙酮酸钠SIGMA公司胰蛋白酶TRYPSINSIGMA公司二甲亚砜DMSOSIGMA公司人工重构基底膜材料MATRIGELSIGMA公司型胶原COLLAGENSIGMA公司葡萄糖苷神经酰氨合成酶抑制剂DPDMPSIGMA公司胎牛血清白蛋白BSASIGMA公司抗人整合素单克隆抗体,ANTIAK7ABDSEROTEC公司22,神经节苷脂GDBDPHARMINGEN公司2抗人整合素单克隆抗体,ANTI,4B7RNEOMARKERS公司112细胞株人脑神经母细胞瘤SKNSH细胞株ATCC号HTB11购自上海细胞生物研究所3各种溶液的配制磷酸缓冲液PBSPH72NACL80GKHPO02G24NAHPO12HO29G242KCL02G三蒸水定容至100ML,高温高压灭菌,室温保存细胞消化液称取05G胰酶终浓度为025溶解于200ML灭菌的PBS溶液中,轻晃混匀后,于室温静置3H或者4过夜充分溶解后,过滤除菌分装于小青瓶中,置20贮存。使用前室温溶解后可预热置37。5暨南大学硕士学位论文NAHCO溶液称取075G终浓度为075溶解于100ML三蒸水中,高压高3温灭菌后分装于小青瓶中,配制细胞培养液时调PH用,常温保存。细胞培养液取胎牛血清10ML,无菌1MMOL/ML丙酮酸钠溶液1ML,青霉素链4霉素混合液05ML终浓度分别为5X10U/L,50MG/L,加入无菌MEM87ML溶液,轻晃摇匀,加无菌075碳酸氢钠调节PH,置4贮存。细胞处理液取1MMOL/LDPDMP溶液10UL终浓度为10UMOL/L,胎牛血清10ML,无菌1MMOL/ML丙酮酸钠溶液1ML,青霉素链霉素混合液05ML终浓度分别为45X10U/L,50MG/L,加入无菌87MLMEM溶液中,轻晃摇匀,加无菌075碳酸氢钠调节PH,置4贮存。无血清细胞培养液取无菌1MMOL/ML丙酮酸钠溶液1ML,青霉素链霉素混合液405ML终浓度分别为5X10U/L,50MG/L,加入无菌MEM溶液,轻晃摇匀,加无菌075碳酸氢钠调节PH,置4贮存。姬姆萨浓缩染液将姬姆萨染粉38G放入纯甘油250ML中,置60水浴2小时,溶解后用60预热的甲醇250M1混匀,于室温、棕色瓶内保存,室温长期保存。使用时取姬姆萨溶液50M1,加PH65磷酸盐缓冲液到500ML,混匀。此液为姬姆萨应用液,可直接作涂片染色用。PH65磷酸盐缓冲液磷酸二氢钾15G,磷酸氢二钠10G、加蒸馏水到5000ML。最后纠正PH65,配姬姆萨稀释液时用。4主要仪器设备SWCJ2F型双面超净工作台苏州净化设备公司CO培养箱FORMA公司2倒置相差显微镜LEICADMIL公司多功能冷冻离心机THERMO公司高压灭菌锅上海跃进医疗器械厂6暨南大学硕士学位论文分析电子天平上海申安医疗器械厂225CM细胞培养瓶CORNING公司12孔细胞培养板BDPHARMINGEN公司TRANSWELLINSERT侵袭小室BDPHARMINGEN公司22实验方法221细胞培养的工作准备在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感,这些物质会影响培养细胞的生长,包括微生物产品附带杂物、上次细胞残留物、非营养成分的化学物质等。需要清洗消毒的培养用品有玻璃器皿、橡胶塞及塑料制品。各种物品可按下方法处理玻璃器皿浸泡刷洗洗洁精烘干泡酸24H流水、单蒸水、双蒸水分别冲洗烘干高温湿热灭菌,121,30MIN。橡胶,瓶塞等流水、单蒸水、双蒸水分别冲烘干双蒸水煮沸30MIN,烘干高温湿热灭菌,115,15MIN。212SKNSH细胞株细胞的复苏及培养按照以下步骤操作1将细胞冻存管从80冰箱中取出,迅速放入预备好的37水浴箱中,并不停地震荡,使其在12分钟内迅速完成复温2以75酒精擦拭冻存管外部,移入无菌操作台内3将细胞冻存液移入离心管,加入适量细胞培养液为冻存液的4倍体积,轻轻摇匀41000RPM离心3MIN,弃上清液5用细胞培养液轻轻悬浮细胞,并计数细胞26将细胞悬液转移入生长面积为25CM的培养瓶中,加入适量细胞培养液其中含104胎牛血清,1丙酮酸钠,青霉素5X10U/L,链霉素50MG/L,075碳酸氢钠7细胞培养瓶放入37、5CO培养箱中培养,第二天换液继续培养28观察细胞状态并及时换液,23天换液一次。212细胞的传代1当细胞在培养瓶中贴壁融合达80左右时,将细胞培养瓶从CO培养箱中取出,在超2净工作台中倒掉培养瓶内的培养液7暨南大学硕士学位论文2无菌磷酸盐缓冲液PBS冲洗两次以除去残留的培养液和血清3向培养瓶中加入15ML025胰酶溶液,轻轻摇动培养瓶,使消化液覆盖所有细胞的表面4将培养瓶放置在显微镜下观察,当细胞胞质回缩,细胞间隙增大时,立即加入4ML细胞培养液终止消化5用弯头吸管吸取瓶内培养液,轻轻反复吹打瓶壁细胞,使细胞脱壁后形成均匀的细胞悬液26将细胞平均分别接种至3个生长面积为25CM培养瓶中,37、5CO培养箱中培2养。7一般情况,传代后的SKNSH细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,67天可在瓶内形成单层,需要再次进行传代。213细胞冻存把生长良好的SKNSH细胞冻存起来可以保存其活性,留待下次使用。当细胞冷冻到零度以下,可以产生以下变化细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冻存,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶反之结晶就大,而大的结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。故本实验采取以下慢冻程序1配制含10二甲亚砜DMSO,20胎牛血清,70MEM培养液的细胞冻存液,4下保存、备用2按照常规方法消化处于对数生长期的细胞,制备成单细胞悬液3将细胞悬液用吸管移至离心管中,以1000RPM离心3MIN4弃去上清,加入冻存液,轻轻吹打沉淀细胞,使细胞均匀重悬65显微镜下细胞计数,调整细胞浓度11010个/ML的悬液6按每管1518ML的量,分装于冻存管中,拧紧盖,做好标记7先将冻存管4冰箱中放置1030MIN,再将冻存管移至20冰箱中放置2小时8将冻存管放置入80冰箱中保存。214细胞观察SKNSH细胞经上述方法培养生长良好,可用于下一步实验,传代后24小时进入指数生长期,细胞贴壁生长,于倒置显微镜下观察,呈菊花团样生长,状如梭形或多角形,细胞与细胞间相互连接,大小均匀。8暨南大学硕士学位论文215细胞的处理41配制含10UMOL/LDPDMP,10胎牛血清,1丙酮酸钠,青霉素5X10U/L,链霉素50MG/L,075碳酸氢钠的细胞处理培养液2将长满培养瓶的处于对数生长期的细胞按常规消化后重悬重悬于4ML培养液中,吹打成均匀的细胞悬液3显微镜下进行细胞计数,按14的比例分别接种到4个培养瓶中,试验组细胞加入细胞处理培养液4每23天换处理细胞培养液一次。216细胞迁移试验1包被胶原用02乙酸将型胶原COLLAGEN配制为25UG/ML溶液,每孔200UL2包被TRANSWELL小室或细胞培养瓶侧壁510UG/CM,室温放置24H风干后放入4冰箱中保存,备用2水化胶原基底膜加入细胞一小时前用无菌PBS溶液冲洗一次,用无血清的细胞培养液冲洗一次3制备单细胞悬液按照常规方法消化对照组和处理组处于对数生长期的细胞,制备成单细胞悬液将细胞悬液用吸管移至离心管中,以1000RPM3MIN离心弃去上清,加入无血清细胞培养液,轻轻吹打沉淀细胞,使细胞均匀重悬6显微镜下细胞计数,使细胞配成110个/ML的悬液5接种细胞A细胞倾斜迁移试验参照STROBEL等所用方法将SKNSH细胞加入包被有鼠尾I型胶原蛋白的细胞培养瓶,培养瓶以80的角度倾斜放置培养箱过夜,让细胞附着在培养瓶的下半部表面第二天早晨,用橡皮细胞刮匙轻轻刮除已迁移出底部的细胞,洗涤培养瓶除去未贴壁的细胞,照片记录细胞的位置0H将培养瓶以15的角度倾斜,再放入培养箱24小时后重新洗涤培养瓶除去未贴壁的细胞,然后照相记录细胞的位置24H。BTRANSWELL小室法参照KANTOR等所用方法将TRANSWELL小室放入12孔培养板,从侧孔向下室内加入600UL细胞培养液,向小室中加入9暨南大学硕士学位论文400UL单细胞悬液,若加整合素抗体抗体终浓度均为10MG/L则37封闭45MIN,若加GD,终浓度为10UMOL/L。26放入37,5CO培养箱中培养18小时27固定及染色吸取小室内细胞液观察是否有未转移细胞用移液器移走TRANSWELL小室内和小室下层腔室内的液体用磷酸盐缓冲液冲洗PBSTRANSWELL滤膜2次用棉签拭去小室内的胶原和细胞用PBS溶液冲洗小室两次将小室底面朝下放在一个洁净的12孔板上,用95的乙醇固定30MIN,用PBS溶液冲洗两次,后用10GIEMSA染色510MIN,用PBS溶液冲洗两次用刀片小心沿小室边缘将膜切下,把膜下表面向上放在干净的玻片上,滴2滴中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,以免出现起气泡200倍显微镜光镜下,在一固定位点的膜水平线及其垂直直径线上定点取6个视野计数细胞即染成紫红色的点计数。217细胞侵袭试验参照ALBINI等所用方法1包被基底膜将106MG/ML的MATRIGEL原液稀释20倍为05MG/ML的MATRIGEL溶液,每孔120UL60UG包被TRANSWELL小室,该步骤在冰上操作后,放入37温箱中2小时后备用2水化基底膜吸除多余的培养液,加入细胞一小时前用无菌PBS溶液冲洗一次,用无血清的细胞培养液冲洗一次3制备SKNSH细胞悬液取对数生长其细胞,用025胰蛋白酶消化,用无血清细胞6培养液配制成110个/ML的悬液4接种细胞将TRANSWELL小室放入12孔培养板中,从小室的侧孔用以液器小心往小室下层腔室内加入600UL细胞培养液,在TRANSWELL小室内加入400UL的细胞悬液,若加整合素抗体抗体均为浓度10MG/L则37封闭45MIN,若加GD,终浓度为10UMOL/L。25培养细胞把12孔培养板移入37、5CO培养箱中培养培养16小时26固定及染色按照以下步骤操作用移液器移走TRANSWELL小室内和小室下层腔室内的液体用磷酸盐缓冲液冲洗PBSTRANSWELL滤膜2次用棉签拭去小室内的胶原和细胞用PBS溶液冲洗小室两次,10暨南大学硕士学位论文将小室底面朝上放在放在一个洁净的12孔板上,用95的乙醇固定30MIN,用PBS溶液冲洗两次,后用10GIEMSA染色510MIN,用PBS溶液冲洗两次用刀片小心沿小室边缘将膜切下,把膜下表面向上放在干净的玻片上,滴2滴中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,以免出现起气泡200倍显微镜光镜下,在一固定位点的膜水平线及其垂直直径线上定点取6个视野计数细胞即染成紫红色的点计数。218统计学处理数据以均数标准差XS表示,利用SPSS统计软件包处理。各组间计量资料的比较采用单因素方差分析,差异显著时用STUDENTNEWMANKEULS法进行两两比较,显著性检验水准取双侧P005。219体外细胞迁移能力的测定通过细胞倾斜实验对细胞迁移能力在不同的实验条件下与对照组相比较,观察实验条件变化后细胞迁移能力的变化,从质的角度初步作出定性的判断。然后进一步通过TRANSWELL小室实验从量的角度对细胞迁移能力的变化给出明确的数量比较。体外TRANSWELL小室细胞培养模型是综合判断肿瘤侵袭转移能力,分析肿瘤细胞粘附、降解和穿透转移能力及相互间联系的最有效且较经典的实验方法,已广泛应用于肿瘤体外侵袭转移能力的检测。TRANSWELL小室内不铺MATRIGEL基膜,观察穿膜细胞数能检测肿瘤体外移行能力。计数穿过微孔移至滤膜下层的细胞数个,并计算细胞迁移平均值和细胞迁移抑制率。2110体外细胞侵袭能力的测定通过TRANSWELL小室实验观察细胞在不同实验条件下细胞侵袭能力的变化,TRANSWELL小室内铺MATRIGEL基膜,MATRIGEL为模拟人体细胞外基质合成人工基质,观察穿过该膜细胞数能检测肿瘤体外侵袭能力。计数穿过微孔移至滤膜下层的细胞数个,并计算细胞侵袭平均值和细胞侵袭抑制率。2111实验分组实验分为1对照组、2含ANTI组、3含ANTI组、4DPDMP处理细胞组、521DPDMP处理后加GD组、GD终浓度10UMOL/L6DPDMP处理后加ANTI组、ANTI2222终浓度10MG/L7DPDMP处理后加ANTI组、ANTI终浓度10MG/L8DPDMP处11理后加ANTI、GD组、9、DPDMP处理后加ANTI、GD组。2212通过实验组1、2、3组之间数据分析,可推理判断整合素在SKNSH神经母细胞2111暨南大学硕士学位论文瘤细胞中的作用通过实验组1、4、5组之间数据分析,可推理判断GLS对SKNSH神经母细胞瘤细胞迁移侵袭的影响通过实验组1、6、7、8、9组之间数据分析,推理判断GLS与整合素对SKNSH神经母细胞瘤细胞迁移侵袭的影响机制之间是否存在关联。212112细胞株的选择1研究不同NB细胞株的GLS含量采用3种不同的NB细胞株KA2,LAN1和SKNSH购于上海细胞生物研究所进行对比研究。3种细胞株均培养成功对这3种细胞株GANGLIOSIDES进行分离提取,3种细胞株高效薄层层析HPTLC分析显示,主要成分相近,为GD或GMMONOSIALOGANGLIOSIDES,232223GM这一结果与以往国外的报道一致。2对3种NB细胞对胶原蛋白COLLAGEN,COL粘附能力进行比较研究三种不同细胞株对胶原蛋白粘附能力的比较研究结果表明SKNSH和LAN1细胞株均显示对胶原蛋白有相对较强的粘附能力A570值SKNSH、LAN1和KA2细胞株分别为045002、0510035和0500022结果显示细胞株LAN1和SKNSH细胞株显示出较强的粘附作用,KA2细胞株相对较弱。3肿瘤细胞对ECM蛋白METRIGEL侵入能力的影响从GLS含量和对胶原蛋白粘附能力的研究表明LAN1和SKNSH细胞株占有明显的优势,故对这两种细胞株对ECM蛋白METRIGEL侵入能力作进一步的比较。为确定这两种细胞株侵入能力,我们使用MATRIGEL包备的含8微米孔的PET膜作为实验模具。观察一定时间内细胞通过该膜的数量。其方式是采用显微镜计数附着于膜下的细胞数。初步结果显示LAN1和SKNSH细胞株侵入的细胞数平均分别为82和86个细胞。两者的侵入能力相近,SKNSH细胞株相对侵入能力较强。4SKNSH细胞神经节苷脂成分分析对三种神经母细胞瘤细胞进行比较,SKNSH细胞株显示出较强的粘附作用和侵袭能力,我们选择对SKNSH细胞神经节苷脂进行分离纯化然后对其成分进行分析,结果表明该细胞神经节苷脂的主要成分为GD。25SKNSH细胞整合素表达采用流式细胞仪检测SKNSH细胞整合素表达情2121况,结果显示该细胞整合素CD49B和CD29均有高水平的表达,表达率分别为97921和999。清除GLS细胞整合素CD49B和CD29表达率分别为939和995。216综上所述SKNSH细胞株符合本课题所需要的实验要求,故选择SKNSH细胞株作为最后的实验对象。12暨南大学硕士学位论文3结果31整合素对SKNSH细胞迁移和侵袭的影响211细胞倾斜迁移实验初步观察到倾斜实验24小时后,整合素图B2、图C221单克隆抗体均能明显抑制SKNSH细胞通过胶原基底膜的迁移能力图3。A1无抗体B1ANTIC1ANTI0HRA2无抗体B2ANTIC2ANTI24HR2121图1整合素对神经母细胞瘤细胞迁移的影响212TRANSWELL小室法结果细胞迁移能力的测定结果表1。表1SKNSH细胞在ANTI和ANTI阻断下细胞迁移能力的测定结果21样本图片细胞迁移计数分组123456789101112131415161718XS1959899921099511610784989994988797100961029872704759483643363468505264555844554751511036164485058506970375844593953545256555491对照组2含ANTI组3ANTI组P00121从以上表1结果显示,实验组2、3穿过微孔移至滤膜下层的细胞数明显少于实验组1对照组,各组细胞迁移细胞均数从高到低的顺序为132,2、3组的细胞迁移抑制率分别为480和449,多因素方差分析示2和3组之间细胞迁移均数无显著性差异P005,1和2、3组之间相比,体外细胞迁移均数之间具有显著性的差异P001,F164。13暨南大学硕士学位论文120细100胞迁80移60数40个200123ERRORBARS9500CI图2SKNSH细胞在整合素抗体阻断前后迁移能力的测定A、对照组细胞迁移图姬姆萨染色200倍211对照组2ANTI组、3ANTI组P00121B、含ANTI抗体组细胞迁移图C、含ANTI抗体组细胞迁移图213体外细胞侵袭实验细胞侵袭能力的测定结果表3。表2SKNSH细胞在ANTI和ANTI阻断下细胞侵袭能力的测定结果21样本图片细胞侵袭计数分组123456789101112131415161718XS14147384442393747384440514446394336314252202429181916222427272833262332322125254320202524211418162322