丙酮固定骨髓活检gma塑料包埋

丙酮固定骨髓活检GMA塑料包埋切片免疫组化检测的研究浦杰莫东华刘健桂林医学院附院血液病科广西桂林541001摘要目的为探讨丙酮固定骨髓GMA塑包切片内保留敏感造血分化抗原的新方法。方法使用冷丙酮固定结合简易三步塑包体系，观察了38例血液病毒者骨髓GMA包埋切片内14种单克隆标记物表达的研究结果。结果此简易三步塑胶包埋体系不仅能提供卓越的细胞形态，细胞抗原性也获较佳保存，并可在切片内进行CMYC原癌基因表达的检测。结论本文建立了一种骨髓活检的简易塑包操作技术，既可获卓越的抗原性保留，也有助于对免疫组化标记物相关的形态学细节进行观察。关键词丙酮固定；骨髓活检；塑料包埋；免疫组织化学STUDYOFIMMUNOHISTOCHEMICALDETECTIONWITHGLYCOLMETHACRYLATEGMAPLASTICCEMBEDDINGSECTIONUSINGACETONEFIXEDBONEMARROWBIOPSIESPUJIE，MODONGHUA，LIUJIANDEPARTMENTOFHEMATOLOGY,THEAFFILIATEDHOSPITALOFGUILINMEDICALCOLLEGE,GUILIN,541001,CHINAABSTRACTOBJECTIVETHEPRIMARYPURPOSEOFTHISSTUDYWASTOEXPLOVEANEWPROCESSINGMETHODTHATPRESERVEDSENSITIVEHEMATOPOIETICDIFFERENTIATIONANTIGENSWITHGLYCOLMETHACRYLATEGMAPLASTICEMBEDDINGSECTIONSUSINGACETONEFIXEDBONEMARROWMETHODUSINGCOLDECETONEFIXATIONWITHASIMPLIFIEDTHREESTEPPLASTICEMBEDDINGSYSTEMWEREOBSERVATEDIN38PATIENTSWITHHENATOLOGICALDISORDERSBYGLYCOLMETHACRYLATEEMBEDDINGSECTIONSFORBONEMARROWBIOPSIESWHICHRESULTSOFSTUDYOF14MONOCLONALMARKERSANDITSEXPRESSIONRESULTSASIMPLIFIEDTHREESTEPPLASTICEMBEDDINGSYSTEMHASBEENFOUNDTOPROVIDEBOTHEXCELLENTMORPHOLOGICDETAILSANDAUTIGENICPRESERVATIONTHEDESCVIBEDHEREDEMONSTRATESTHATFORCMYCEXPRESSIONINBONEMARROWBIOPSIESSECTIONSCONCLUSIONWEDESCRIBEHEREASIMPLIFIEDPLASTICEMBEDDINGTECHNIGUEFORBONEMARROWBIOPSIESWHICHALLOWSACHIEVEEXCELLENTAUTIGENCEPRESERVATIONANDHIGHQUAHITYOBSERVATIONOFMORPHOLOGICALDETALSINRELATIONTOIMMUNOHISTOCHEMICALMARKERSKEYWORDSACETONEFIXATION；BONEMARROWBIOPSY；PLASTICEMBEDDING；IMMUNOHISTOCHEMISTRY乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）塑包剂于室温下聚合时不仅强烈放热，并可与蛋白质氨基终端位结合而遮蔽细胞表面抗原决定簇，阻抑抗原抗体间反应，无法进行免疫表型检测，本文报道以冷丙酮固定结合简易三步塑包体系可有效进行骨髓切片免疫酶标染色的研究，适于在任何条件的血液病理实验室中推广应用。1资料和方法11病例2008年2月2011年6月共收集38例各种血液病患者；男21例，女17例；年龄1582岁。计骨髓增生异常综合征（MDS）难治性贫血（RA）2例，伴多系病态造血的难治性血细胞减少症（RCMD）3例；急性髓细胞白血病（AML）M12例、M24例、M32例、M52例和M62例；急性淋巴细胞白血病（ALL）5例；慢性髓细胞白血病（CML）慢性期4例，CML急粒变3例；慢性淋巴细胞白血病（CLL）3例；缺铁性贫血2例和溶血性贫血4例。各例均于治疗前以B6501型骨髓活检针于骼后上棘局麻后作一步法抽吸一活检双标本取材，活组织块在23MMX1013MM间。12包埋剂配制甲液甲基丙烯酸二羟基乙基酯单体（HEMA）40ML，过氧化苯甲酰009G，NN二甲基苯甲胺20ML，充分摇匀，全溶后置棕色玻瓶内4保存备用。乙液聚乙二醇（PEG400）10ML，NN二甲基苯甲胺1ML，混匀，4备用。全包埋液配制甲液42份（本室特制模具84滴），加乙液1份（8号针头3滴）。13切片操作步骤骨髓块置于20丙酮（100ACS级）中，时时摇动固定2H，用针头挑入特制模具底部，用滴管吸取改良GMA单体甲液滴入模具中，使满（约2ML），置4冰箱中2H，取出包埋模具用带8号针头之注射器吸取乙液3滴加入模具中，用细竹签迅速将甲、乙两液搅匀成全包性液，将活检块摆正于模具底部中央位置，静置于4冰箱内自聚过夜。包埋块修正后切割成34UM厚切片，移入事先滴加数滴氢氧化氨液之水溶上，使之平坦飘浮于水面，冷水溶中裱片，常规贴片。14切片免疫组化染色用APAAP法，本文所用一抗详见表1。二抗为为碱性磷酸酶结合的兔抗鼠IGG，三抗为APAAP酶标复合物，三者均于温盒内室温下孵育30分钟，滴加碱性磷酸酶底物显色液20ML后于37下孵育显色20MIN。水洗后MAYER苏木素复染胞核4MIN，水洗，甘油明胶封片后镜检。对照切片用正常AB血清替代一抗进行相应染色。2结果本文以改良GMA树酯和冷丙酮固定组织简易三步塑包体系，证明既能提供优良的细胞与间质结构形态，又能使细胞抗原获得较佳保存。主质内祖细胞、粒系、红系、巨核系和淋巴系细胞分化抗原定位与显色优良，详见表2表1丙酮固定骨髓塑包切片中所用的单克隆标记物所用单抗CD标志主要细胞反应性稀释度MY10,HPCA1CD34干、祖细胞、破骨细胞，血管内皮1/404D1，M704IAHLADR表达细胞，属II类缓缓相容抗原1/40MY7CD13粒系细胞，单核细胞1/50MY1CD15粒系细胞，单核细胞1/50MY9，H153CD33粒系和单核系细胞，祖细胞1/50J15CD41巨核系细胞，血小板1/20GLYCOPHORINA红系细胞1/50LEU5,OKT11CD2全T细胞1/50LEU4,OKT3,M756CD3全T细胞1/50LEU1,OKT1CD5全T细胞，BCLL1/50LEU9,OKT16CD7全T细胞，原淋巴细胞1/50LEU12,B4CD19全B细胞，原淋巴细胞1/50LEU16,B1CD20全B细胞1/50LEU14,B3CD22后期B细胞，毛细胞1/50CMYE白血性髓系前体细胞1/50表2切片造血主质不同细胞系的免疫标记物表达单抗细胞类型CD34CD33CD13CD15CD41HLADRGLYACD2CD3CD5CD7CD19CD20CD22干、祖细胞/髓系前体细胞/红系细胞巨核系细胞/单核巨噬/细胞内皮细胞破骨细胞全T细胞/全B细胞本文2例RA，3例RCMD，12例AML，4例CML慢性期和3例CML急接变患者之骨髓切片以CD33、CD15和CD13单抗染色时，各例原始细胞和髓系前体细胞之胞浆内均呈阳性反应，但阳性标记物之表达呈显著异质性，本组1例RA，2例REMD，7例AML（M12例，M23例，M51例和M61例）和CML急检变2例之切片比单抗CD34作免疫标记检测时，均可检出少数CD34抗原表达之祖细胞，且各侧切片破骨细胞，血管周围外膜型网状细胞和血管内皮细胞也均显示CD34阳性反应。本组2例AMLM6，2例RA和4例溶血性贫血之骨髓切片以血型糖蛋白（GLY,A）作标记显色时，各例切片内的幼红细胞集簇和四周渗出血管外的红细胞均显示玫瑰红色阳性反应。而同一切片内的淋巴细胞集簇则呈GLY，A阴性，有助于两者的鉴别。4例CML慢性期患者之切片以CD41单抗染色后于多形性巨核细胞（含直径15MM之微巨核）之胞浆均呈深红色阳性反应，提示此法对微巨核显色优良，利于精确识别。5例ALL和3例CLL，以全（CD19，CD20，CD22）和全T（CD2、CD3、CD5、CD7）单抗标记时，3例ALL和2例CLL之白血性B细胞上分别显示不同程度的CD19、CD20和CD22抗原之表达。本组3例CML急粒变，2例M2，1例M3和2例M6患者之切片作了原癌基因CMYC表达之检测，各例均可显示弥散性或簇性分布之CMYC阳性标记细胞。3讨论乙醇甲基丙烯酸酯（GMA）塑胶包埋较之传统的石蜡包埋表现出下列两方面的重要优点12（1）由于包埋操作采用了制冷真空系统，使得细胞表面热敏感抗原获得较佳保留；（2）塑包切片之细胞和间质形态明显较石蜡切片为优，从而为切片内细胞形态与标记物表达反应间提供可靠保证。早年塑包切片免疫组化检测中常用的制冷一真空系统操作复杂1，难以在一般血液病理实验室中推广应用。故探讨能有效进行免疫标记物表达检测的简易塑包方法具有现实意义。BECKSTEAD3最先使用多聚甲醛固定骨髓块后于低温下进行GMA包埋，切片需经胰蛋白酶消化处理，不仅累及细胞形态及其抗原性，而且T细胞亚群之标记抗原也无法被证实。CASEY等4进而证明，免去胰蛋白酶消化这一步，于免疫标记前先用5甲基苯甲酸盐加入GMA单体浸渍液中，赖以包埋丙酮固定的骨髓块，证明甲基苯甲酸盐能保护GMA聚合过程中抗原不被遮蔽。但仅能在用丙酮固定的组织块中抗原才会被保留，如若改用其它固定剂反应就会转阴。本文介绍的骨髓活检块以冷丙酮固定，GMA单体浸渍，以及聚合等三步简易操作方法，主质内各系血细胞的分化抗原定位与显色优良，为了能长期保留免疫反应，必须在聚合后即刻切割大量切片保存备用。由于包埋后的“超聚合作用”致使因不可逆遮蔽抗原决定簇而使内边的免疫反应性均告丧失。本文介绍将塑包块置于20冰箱内贮存数月后再切片，免疫反应性仍能持久保存，对回顾性研究十分有用。参考文献【1】浦权，杨梅如，血液病骨髓诊断病理学M。北京科学出版社，2002113。【2】FARHIDGPATHOLOGYOFBONE（MARRON）ANDBLOODCELLS（2ND）NEWYORKLIPPINCOTTWILLIAMSWILKINS,2009。【3】BECKSTEADJHOPTIMALANTIGEENLOCALIZATIONINHUOUANTISSUESODIUGAL