th17细胞在川崎病发病机制中作用研究（可编辑）

TH17细胞在川崎病发病机制中作用研究密级UDC重庆医科大学硕士学位论文论文题目塾Z塑堕垄删堕壅叁疸垫剑主笪堡旦婴窒作者姓名婆塞整一指导教师姓名职称、单位名称申请学位级别硕学科、专业名称儿科学论文答辩年月三Q璺生墨旦2010年5月IIIIRLLLFLLLLLLLFLLLLLLLLLLY1730527重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。；申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。，学位论文作者签名主塑童乏碴日期丝翌颦垒旦塑学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。指导教师签名日期目录英汉缩略语名词对照1中文摘要4英文摘要9论文正文THL7细胞在川崎病发病机制中的作用研究。16第一部分43例川崎病临床资料分析16前言161材料与方法。162结果173讨论194结论205参考文献20前言。221材料方法。222结果。263讨论。304结论。335参考文献33第三部分川崎病转录因子RORTT及IL6、IL23水平38前言381材料方法382结果433寸论。484结论505参考文献5L全文小结一53文献综述54致谢64攻读硕士学位期间发表的学术论文65英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称ABANTIBODY抗体APCCELL抗原提呈细胞ANTIGENPRESENTINGBASE碱基对BPPAIRAIBULIN牛血清白蛋白BSABOVINESERUMLESIONS冠脉损害CALCORONARYARTERY互补脱氧核糖核酸DEOXYNUCLEICCDNACOMPLEMENTARYACIDOFDIFFERENTIATION分化群CDCLUSTERCD40LCD40CD40配体LIGANDARTHRITIS胶原诱导性关节炎CLAINDUCEDCOLLAGENREACTIONC反应蛋白CRPCPROTEIN天DDAYCELL树突状细胞DCDENDRITICDMSODIMETHYLSUIPHXIDE二甲基亚砜DNAACID脱氧核糖核酸DEOXYRIBONUCLEICEAEAUTOIMMUNE实验性自生免疫性脑脊EXPERIMENTALITIS髓膜炎ENCEPHALOMYRL酶联免疫吸附实验ELISAIMMUNOSORBENTENZYMELINKEDRATE红细胞沉降率ESRSEDIMENTATIONERYTHROCYTESERUM胎牛血清FBSFETALBOVINEFCMFLOW流式细胞术CYTOMETERYFLTCFLUORESCEIN异硫氰酸荧光素ISOTHIOCYANATEIFNQ,INTERFERON吖R干扰素G免疫球蛋白GIGGIMMUNOGLOBULINIL6INTERLEUKIN6白细胞介素6重庆医科大学硕士研究生学位论文LL一17INTERLEUKINL7白细胞介素17LL23INTERLEUKIN一23白细胞介素23LRAKILLKINASELL1受体相关激酶RECEPTORASSOCIATEDLVLGINTRAVENOUS静脉注射丙球GAMMAGLOBULINKDKAWASAKIDISEASE川崎病M西MACROPHAGE巨噬细胞MCMONONUCLEARCELL单核细胞MINMINUTE分钟MLMILLILITER毫升MM【PSMETAL基质金属蛋白酶LOPROTEINASESMSSCLEROSIS多发性硬化MULTIPLENKCELINATURALKILLERCEIL自然杀伤细胞ODOPLICALDENSITY光密度ORODDSRATIOS比值比PBMCBLOODMONONUCLEARCELL外周血单个核细胞PERIPHERALPBSBUFFERSALINE磷酸盐缓冲液PHOSPHATEPCRCHAINREACTION聚合酶链反应POLYMERASEPEPHYCOERYTHIN藻红蛋白PGE2E2前列腺素E2PROSTAGLANDINPLTPIATELET血小板RARHEUMATOIDARTHRITIS内风湿关节炎RNARIBONUCLEICACID核糖核酸RETINOIC孤独核受体RORTTORPHANRECEPTOQ,TROLLSMINUTE每分钟转数RPMPERLMPCRREVERSE逆转录聚合酶链反应TRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTIONSSECOND秒SDSTANDARDDEVIATION标准差THLLCELLSI型辅助T细胞TYPETHELPER2重壅墨型奎兰堡主里窒竺兰垡堡茎一_一一2T1I型辅助T细胞TH2TYPEHELPERCELLS17TCELLS辅助性T淋巴细胞17THL7TYPEHELPERFACTOR肿瘤坏死因子邢TUMORNECROSISTCELL调节性T细胞TREGREGULATORY微克“GMICROGRAMMICROLITRE微升ITLCELLS白细胞WBCWHITEBLOOD重庆医科大学硕士研究生学位论文LTH7细胞在川崎病发病机制中的作用研究摘要背景JILLIL奇病KD是儿童最常见的一种自限性的自身免疫性血管炎综合症，自1967年日本人首次报道川崎病以来，该病在世界范围各种族儿童中均有报道。以持续性发热、口唇潮红、球结合膜充血、手足硬肿脱屑等皮肤、粘膜、淋巴结的炎性症状为主要临床表现。KD以免疫系统活化和血管内皮系统广泛损害为特征，主要累及全身中小动脉，特别是冠状动脉，部分患儿冠脉扩张可形成冠状动脉瘤，少部分患儿冠状动脉可发生狭窄或血栓，甚至导致心肌梗死。JIIII病已经超过风湿热成为儿童后天性心脏病的首要原因，也是成人后发生冠状动脉损伤的重要原因。40多年以来KD一直受NJI,科学和免疫学家的高度重视，从病因，发病机制，治疗，预后及干预因素等方面进行了广泛研究，但KD免疫发病机制迄今未完全阐明，大量流行病学及临床观察提示感染因素所触发的急性炎症和免疫调节紊乱是KD发生冠脉病变的关键。已有报道多种细菌，病毒，支原体及其代谢产物导致免疫细胞，尤其是等在KD患儿急性期高表达，特别是IL6可能参与血管内皮损伤，与KD患儿冠脉损害有关。在参与本病发病过程的众多活化、升高的炎症细胞和分子中，是否有急性炎症反应的启动因素和转归的枢纽尚不清4重庆医科大学硕士研究生学位论文楚。THL7细胞足近年发现不同于THL和TH2，具有产生白细胞介素17IL17功能的又一群CD4辅助性T细胞亚群，具有很强的促炎作用。介导炎症反应防御胞外细菌，真菌感染，参与自身免疫性疾病，移植排斥反应和肿瘤免疫过程。11117及其产生的细胞因子IL17在多种急慢性炎症和自身免疫性疾病的调节轴中占据中心位置如类风湿和MS的动物模型，在IL17缺陷的小鼠中，其病情的进展明显缓慢。目前研究也表明RORYT是掌管THL7分化的关键转录因子，它诱导编THL7细胞。但有关THL7和KD急性期的炎症关系尚未见报道。TREG是一类具有免疫抑制作用的T细胞亚群，有抑制自身免疫T细胞活化和维持自身免疫耐受的功能。其数量的减少或功能障碍可引起自身免疫功能紊乱。目前在多种疾病及动物模型中发现TREG数目减少，THL7数目增多，THL7TREG失衡。但在急性期KD患儿体内是否存在THL7TREG失衡尚不清楚。关的转录因子及细胞因子水平，旨在进一步探讨KD的免疫发病机制。目的1、通过总结43例急性期川崎病患儿临床病史资料进一步了解川崎病的临床特点和危害性；2、流式细胞术分别检测KD患儿急性期外周血THL7细胞、TREGS重庆医科大学硕士研究生学位论文KD发病中的作用；3、检测THL7细胞特异的转录因子RORYT的表达，及相关细胞因子IL6、IL2水平，探I寸LL崎病急性期THL7细胞增高的机制；方法L、总结43例急性期川崎病患儿临床病史资料；2、流式细胞术分别检测KD患儿急性期IVIG前、正常体检儿占CD4细胞的比例，及IVIG后随访患LTHL7细胞比例；4、双抗体夹心酶联免疫吸附法ELISA检测血清IL一6水平；结果1、43例患儿中典型川崎病37例86；不典型川崎病程740187天，其中两例冠脉瘤患儿热程分别为9天、10天，而不典型KD热程并无明显延长；双侧结膜充血34例791；唇红、皲手足硬肿、指趾端脱屑34例791；颈淋巴结肿大33例767；室检查发现急性期患儿白细胞总数及粒细胞增高1638土1562109L，MM1血沉明显增快4476士2768H，C反应蛋白增高8507士7044MGL，两例冠脉瘤患儿血沉、CRP明显升高；在IVIG治疗后这些炎性指标显著下降PO01；6重庆医科大学硕士研究生学位论文用IVIG后随访患儿THL7细胞数、对照48072045】9005。3、急性期KD患儿THL7细胞转录因子RORYT的基因表达量尸O05。健康对照组比较无显著差异M173，Q279，4、急性期KD患儿血清IL6水平显著增高【病人19424显著高于无冠脉损害脉损害患儿IL6水平M6691，QI组M882，Q1473，P001。例成正相关RO88结论1、本组KD病例临床特征43例急性期KD患儿中包括37例典型KD，6例不典型KD；心脏彩超检查可发现冠脉扩张34例，冠脉瘤2例；实验室检查外周血白细胞，血沉、血小板，CRP升高，部分心肌酶谱及免疫球蛋白水平升高，尤其是冠脉瘤患儿热程较长，炎性指标明显升高，不典型KD各项炎性指标较典型者并无明显升高；IVIG治疗后，CRP、血沉、白细胞等炎性指标明显下降，仅血小板无明显下降反而轻度升高。77重庆医科大学硕士研究生学位论文细胞占CD4细胞的比例显著高于同龄健康对照组，且在IVIG治疗后TREG占CD4细胞的比例与同龄健康组比较无显著差异；在急性期KD患儿体内，可能不存在THL7TREG失衡，可能是在急性炎症的早期，THL7介导的炎症反应占据了主要作用；细胞转录因子RORYT的表达显著高于同龄健康对照组，其相关细胞因子IL6也显著升高，尤其是在有冠脉损害的患儿。且IL6水平与THL7细胞的LL,侈LJ呈正相关，但IL23P19的表达和健康同龄儿无显著差异。增高的IL6、THL7可能创造了一个初始的炎症微环境，导致多种炎性因子的释放和级联反应，促进了KD的炎症发展和血管损伤。关键词THL7，川崎病，RORVT，TREG8重庆医科大学硕士研究生学位论文7ONTHEOFTHLCELLSTHEEFFECTSDISEASEOFKAWASAKIPATHOGENESISABSTRACTTHEMOSTCOMMONDISEASEKDISBACKGROUNDKAWASAKIFIRSTDESCRIBEDAVASCULITISINCHILDHOODSINCEBYAUTOIMMUNESYNDROMEIN1BEENDISEASEKDHASREPORTEDJAPANESEGROUP967，KAWASAKICHILDRENOFALLRACESPERSISTENTWORLDWIDEFEVER,FISSUREDLIPS，AMONGOFHANDSANDCONJUNCTIVALFEET，SOOFTOESINCONVALESCENTON，WHICHDESQUAMATIONPHASE，ANDPERIUNGUALACTIVATIONANDBLOODMANIFESTATIONIMMUNEARETHEMAINCLINICALSYSTEMINVOLVEINMEDIUMSIZEDTHEMAINAREENDOTHELIALCHARACTER，WHICHSYSTEMARTERIOLESOMECHILDRENANDTHEARTERY，ANDMAYARTERYARTERIOLE，ESPECIALLYTHEOCCURSTENOSISORHAVECORONARYARTERYMAYCORONARYANEURYSM，SMALLINFARCTIONKDHASRHEUMATICFEVERTHROMBOSIS，EVENMYOCARDIALREPLACEDINTHEMAINOFHEARTDISEASEASTHECAUSEACQUIREDCHILDREN，ALSOLEADINGCAUSEOFINADULTCORONARYARTERYDAMAGESUBSEQUENTINTHEANDHAVEIMMUNOLOGISTSPASTFORTYYEARS，PEDIATRICIANSTHEANDRESEARCHEDPROGNOSIS，EXTENSIVELYETIOLOGY，PATHOGENESIS，THERAPYNOTCLEARFLLUMMAILLUMINATEDTEATATPRESENTAVARIOILTSITSOATHOG,LSVARIETYPATHOGENESISCLEARLYPRESENTHAVETHATACUTESTUDIESANDCLINICALOBSERVATIONSEPIDEMIOLOGICALSUGGESTED9重庆医科大学硕士研究生学位论文ANDIMMUNETHEINFECTIOUSINFLAMMATIONBYAGENTS，DYSFUNCTION，TRIGGEREDOFKDITHASBEENTHATAOFAREICATEDINTHECALREPORTEDVARIETYIMPLTOABCONTROLANDTHEIRMETABOLITESLEADBACTERIA，VIRUSES，MYCOPLASMAWHICHOFIMMUNETHECD4CELLSACTIVATIONCELLS，ESPECIALLYPRODUCEASANDTNF0TINCREASEDNUMEROUSIL一6，IL8SIGNIFICANTLYCYTOKINESSUCHIL6CRITICALINCREASEDINCHILDRENWITHACUTEMAYPLAYKD，ANDESPECIALLYTHESEINBLOODVESSELENDOTHELIUMMOLECULES，THEROLESLESIONSO，AMONGOFACUTEINFLAMMATIONWASINITIATIONANDOUTCOMESROLEOFIL6INTHEUNCLEAROFTDIFFERTHL7CELLISONEOFSUBSETSTHECD4十HELPERCELLST11EYTH2ANDCANIL17STUDIESHAVEFROMTHLANDCELLSTHEYPRODUCETHL7WEREINCONFIRMEDTHATCELLSIMPLICATEDARELIKETOTUMORCELLSANDIMMUNITYTHL7REJECTIONDISEASES，TRANSPLANTINACUTEANDCHRONICANDAUTOIMMUNETHECRITICALROLEINFLAMMATORYPLAYASRHEUMATOIDBOWELDISEASEDISEASES，SUCHARTHRITISRA，INFLAMMATORYIL17KNOCKOUTSCLEROSISMSINMICE，THEMULTIPLEIBD，ANDOFINDUCEDCOLLAGENARTHRITISCIAANDEXPERIMENTALDEVELOPMENTAUTOIMMUNEPROFOUNDLYENCEPHALOMYELITISEAEWASSHOWEDTHATWASTHEFACTORFORTHL7STUDIESRORYTKEYTRANSCRIPTIONINDUCEDOFIL17ANDTHEDIFFERENTIATION，WHICHEXPRESSIONPROMOTEDOFIL一6INTOTHL7CELLSUNDERTHESTIMULATIONOFCD4TCELLSDIFFERENTIATIONTHL7ANDACUTEKDHASNOTBEENANDTHEBETWEENTGFPBUTRELATIONSHIPREPORTEDTCELLHAVETHETOINHIBITOFTHCELLSWHICHABILITYISAKINDTREGNUMBERORIMMUNETHEREDUCEDANDMAINTAINTOLERANCE，ANDACTIVATIONOFDISORDERSACANCAUSEAUTOINUNUNEVARIETYOFCELLSTREGDYSFUNCTIONTHENUMBEROFREDUCEDBEENFOUNDANIMALMODELSHADTREGDISEASEANDWHETHERTHL71WASIMBALANCEHOWEVERWHILEINCREASED，THETH7TREGKDNOTWITHACUTEOFTHLEXISTINCHILDRENYETTHEREIMBALANCE7TREGBEENREPORTEDNUMBEROFTHL7CELLSANDINTHESTUDY,THETREG，PRESENTRELATEDRETINOIDRELATEDINFLAMMATORYRECEPTOR竹RORYTANDORPHANINTHEACUTETOTHEROLEINKDCHILDRENEXPLOREWERESTUDIEDSTAGECYTOKINESINKDOFTHL7CELLSCHILDRENWITHCLINICALDATAOF43CASESSUMMINGUPOBJICTIVE1BYHARMFEATURESANDMOREABOUTTHECLINICALTOLEARNKAWASAKIDISEASEACUTEOFKDAND2THEOFTHL7CELLSPROPORTIONFLOWBLOODWEREWITHCYTOMETRY，TOTCELLSTREGINPERIPHERALANALYZEDKAWASAKIDISEASEOFTHL7INTHEROLEINVESTIGATECHAINTO3REALTIMEREACTIONRTPCRWASPERFORMEDPOLYMERASETHL7THEMRNAOFTRANSCRIPTIONEVALUATEEXPRESSIONANDFURTHERTHEROLEOFRELATEDSTUDYLEVELOFIL23，TOTHECYTOKINEIL6DISEASEL7INCREASEDINKAWASAKITH11CLINICALDATAOFCHILDRENWITH43CASESMETHORDS1SUMMARYUPDISEASEACUTEKAWASAKITHEOFTHL7CELLSAND2FLOWANALYZEPROPORTIONCYTOMETRYINCONTROLCHILDRENINCD4CELLSTCELLSCD4CD25FOXP3REGULATORYTHL7CELLSWEREBEFOREOFANDTHEPROPORTIONPATIENTSIVIG，MEANWHILE，THEIVIGINAFTERDETECTEDFOLLOWUPPATIENTSCHAINTOPERFORMED3REALTIMEREACTIONRTPCRWASPOLYMERASEOFRETINOIDRELATEDTHEMRNAORPHANRECEPTOR竹EVALUATEEXPRESSIONBLOODPERIPHERALINTERLEUKIN一23IL23INRORTTANDLEVELOFIL一6WASBYENZYMELINKED4THEPLASMAASSAYEDIMMUNOSORBENTSAASSAYELI37OFKDWERECASES86，THE43CASESRESUITS1INKD，COMPLETETHEHADA00，THEKDHIGHFEVER16CASES14，ALLPATIENTSATYPICALFEVERFEVERWAS412DAYDAYDAYS，AVERAGEWEREAND10DAYS，HOWEVER，WITH9DAYSTWOANEURYSMTHECORONARYPATIENTSWERENOTINJECTION34THEKDSIGNIFICANTLYPROLONG；CONJUNCTIVALATYPICALLIPS36CASES791；FISSUREDHANDSANDOFSTRAWBERRYFEET34CORONARYARTERYHADTWOWITHWHICH，WEPATIENTCORONARYCASES791，INLESIONCAL34THEACUTEWBCHADFOUNDINEXAMINATIONKD，THEANEURYSM；LABORATORYWERESIGNIFICANTLYANDINCREASED16381562109L，ESRGRANULOCYTE重庆医科大学硕士研究生学位论文_L一MMLSIGNIFICANTLYELEVATION4476士2768H，CRPTHEOBVIOUSWITHESR，CRPINCREASE；PATIENTCORONARYANEURYSMMGL。TWOMARKERSDECREASEDAFTERIVIGINFLAMMATORYTREATMENT，THESE1SIGNIFICANTLYP0OACUTETHL7FROMWITHKDINTHE2THEOFPATIENTSPHASEPROPORTIONWEREINCREASEDASCOMPAREDSIGNIFICANTLYWERE1。285士0625，WHICHWITHTHE1；AFTERCONTROLSO584土0407，P0OINTHEWASFOUNDDIFFERENCE1；NOSIGNIFICANTSIGNIFICANTLYPOOOFPROPORTIONPO05INOFMRNAFROMWITHKDTHE3THERORTTPATIENTSEXPRESSIONWEREINCREASEDASACUTE6，WHICHSIGNIFICANTLYWEREM562，Q71PHASEWITHTHESIGNIFICANTCOMPAREDCONTROLSM179，Q255，PO01；NOIL一23MRNABETWEENINTHEOFPATIENTSWASFOUNDDIFFERENCEEXPRESSIONANDHEALTHY279】，胗O05IL6INOFCHILDRENWITH4THELEVELOFPLASMAKDM3642，QTHANINCHILDRENM1MARKEDLYHIGHERAGEMATCHEDHEALTHY2977WASCALHASTHANTHESIGNIFICANTLYHIGHERPATIENTS5PO01，THE239，Q11BETWEENTHENCAL