[新型酶固定化技术研究进展] 关于酶的最新研究进展

1、新型酶固定化技术研究进展 关于酶的最新研究进展doi:10.13746l ）。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。collioud 7等化学合成一个异双功能试剂(n-m-3-(trifluoromethyl)diazirin-3-lyphenyl-4-maleimidobutyr amide) ，利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、合成肽和抗体fab 片段的定向固定。stein 8等通过衍生全氟叠氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白，取得了一致的空间取向。固定后的蛋白

2、质分子结合牢固、稳定性佳，不能被离子或非离子去污剂清除。抗体结合显示该固定保持了蛋白质分子的天然构象。min 12等将生物素羧化载体蛋白(bccp)片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的n 末端，然后将这两个融合蛋白（bccp -荧光素酶、bccp-氧化还原酶）定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定性和固定效率均大大提高。vishwanathl 13等将携带一段生物素连接酶可识别肽链碱基序列的-半乳糖酶基因融合到大肠杆菌细胞质dna 中。经转录翻译后，表达出来的-半乳糖酶特定位置n 端携带了可识别肽链。在生物素连接酶作用下，可识别端连接-分子生物素。最后将修饰后的-

3、半乳糖酶与已连接有链霉1.2氨基酸置换法利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。半胱氨酸为低频氨基酸，在蛋白质分子中的出现频率约为2%，其巯基可以与载体的碘乙酰基团发生烷基化反应。半胱氨酸还能与金属表面牢固结合，在二氢叶酸还原酶c 末端引入后，在金属表面固定的酶量比野生型酶高出4倍6。-亲和素的聚醚砜膜作用，实现-半乳糖酶的定点固定化。研究发现，定点生物素化酶的活力是全生物素化酶的huang 9等通过定点突变在枯草蛋白酶分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(cys)残基。经蛋白质空间折叠后暴露出cys ，然后利用cys 残基

4、上的巯基固定枯草蛋白酶分子，取得了较好的固定效果。固定效率和固定后催化活性均有很大提高。2倍，该法制备的生物催化膜的酶活是随机固定化法的近20倍。1.5酶与金属离子连接金属螯合载体可以和蛋白质表面供电子的氨基酸，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯醇基以配位作用紧密结合。刘婷14等人采用反向悬浮包埋法制备了磁性琼脂糖微球，将其ida 化后，加入一定量的cuc1溶液中，得到琼脂糖-ida -cu 螯合载体，利用金属螯合配体(ida-1.3抗体耦联法大多数抗体具有足够的稳定性，承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团。可以通过赖氨酸的-氨基或末端氨基、天冬氨酸的-氨基、谷氨酸的-氨基或末

5、端羧基进行一般性的偶联。抗体的二硫键还原后形成的半分子亦可以提供远离抗原结合位点的巯基作为偶联位点。cu 2+) 与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶。结果表明，固定化酶活力回收率为68.4%，有较好的热稳定性，载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次的79.71%。schmid 等将螯合剂次氮基三醋酸共价结合在亲水性石英上，然后再连上二价金属离子(ni2+) ，螯和剂-金属离子复合物上的自由协调位点可以和供电子基团如组氨酸连接。这样就可以通过金属离spitznagel 10等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48g7-4a 1的fab 片段，抗体酶fa

6、b 片84酿酒科技x年第6期（总第192期）liquor making science technology xno 6(tol 192)子镍将蛋白质和载体连接在一起。次后，其剩余酶活仍能保持在72%。1.6疏水定向固定法细胞粘着分子(cams)是介导细胞-细胞、细胞-底2.4超声波处理在适当的超声场条件下，由于超声波的空穴和高频物粘着、细胞发育和细胞信号发生的分子。细胞粘着分子和其他细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定是常选择的方式。接触位点a 糖蛋白可通过神经酰胺疏水固定在细胞表面。疏水定向固定可保持蛋白质分子结构、生理活性及天然构象。这种通过疏水作用的固定，固定的效率高，

7、固定为非共价，而且固定过程可逆，用去污剂可终止或消除固定反应。振荡作用，反应液中的底物和产物分子在超声波的驱使下，以较高的频率振动，固定化酶与底物和反应物的接触次数大大增加，促使底物和产物分子迅速进入和排出载体，从而使固定化酶的反应速度增加，活力增大。陈小丽、黄卓烈19等为了探索不同参数超声波对淀粉酶活性的影响效果，将水稻淀粉酶经分级盐析初步纯化后，用deae -纤维素进行柱层析。层析结果分离出2个蛋白峰，第1个蛋白峰无酶活力；第2个蛋白峰有很高的酶活力，且酶活力峰与蛋白峰吻合。将此峰中蛋白成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果显示的蛋白带比粗酶的蛋白带明显减少，经柱层析后淀粉酶被纯化13.72

8、6倍，将部分纯化的淀粉酶用适宜参数的超声波处理可以使酶活力提高9.09%33.09%。stein 8等用庚基胺修饰羧甲基葡聚糖载体表面的羧基来疏水固定接触位点a 糖蛋白分子，成功地控制了固定位点的空间取向。22.1其他技术处理辐射处理-射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。梁足培、桑明心、李建等将co 60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性，在微波辐射下以戊二醛为交联剂，将壳聚糖球交联引入醛基，然后将交联的壳聚糖球浸泡在脲酶溶液中24h ，制

9、备了壳聚糖球固定化脲酶，其酶比活为10183u/g载体。162.5磁处理磁性体fe 3o 4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物（如铁、钴、镍及其氧化物），而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。王艳、聂志勇20等建立了以纳米级磁性壳聚糖微球为载体固定化酵母醇脱氢酶的方法，优化了yadh 的固定化条件，考察了固定化酶的性质。结果表明，纳米级磁性壳聚糖微球呈规则的圆球形，粒径在30nm 左右，具有较好的磁响应性。相对于游离的酵母醇脱氢酶，固定化酶的

10、最适温度略有升高，可明显改善其热稳定性、酸碱稳定性、操作稳定性和贮存稳定性。2.2等离子体处理等离子体用于固定化酶具有操作简单、条件温和、单位面积固定的酶数量多、酶结合牢固等优点。刘小冲，孙巨峰、金文等利用ar 等离子体引发ptfe 膜接枝丙烯17酸(acrylicacid) ，然后进行固定化脲酶，最终得到ptfe -g -paac -i urease 膜。结果表明，在ptfe 表面固定上了脲酶，固定化脲酶保持了与溶液脲酶相当的活性，与溶液酶相比固定化脲酶的环境稳定性有较大的提高。3展望目前，酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工2.3纳米技术处理将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于

11、业、医药，特别是手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展。随着人类对环保的日益关注，酶的应用会更受关注，如何充分利用新载体、新方法来进一步提高固定化酶的活力、回收率、延长半衰期、降低成本必定会成为固定化酶研究领域的热点。同时，开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力，也是未来研究的重点和方向，而固定化酶在各行业的应用研究也必将推动酶固定化技术的发展。纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。薛正莲，汤斌18等分别以醋酸纤维素tio 2膜(ac.tio 2膜) 、羧甲基

12、纤维tio 2膜(cmc.tio2膜) 和聚丙烯tio 2膜(pp.tio2膜) 为载体吸附固定糖化酶，并与醋酸纤维素、羧甲基纤维素和聚丙烯固定糖化酶的性能进行了比较，得出以ac.tio 2膜和pp.tio 2膜对糖化酶的吸附性能及稳定性能均较好，pp.tio 2膜固定的糖化酶使用8参考文献：1胡和兵，王牧野，等. 酶的固定化技术及应用j.中国酿造，x，（7）：4.张萍，侯红萍新型酶固定化技术研究进展23456赵海峰. 传统的酶固定化法及改进方法j.医药化工，x，8511孟艳丽，王战会，靳刚.a 蛋白定向固定抗体用于椭偏光学生物传感器免疫检测j.生物工程学报，x,(1)：111-114.(2)

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