色谱技术在药物分析的应用反相HPLC在药物分析中的应用.ppt

1、反相HPLC在药物分析中的应用 （成都 2010/09） 曾伟杰 ,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题 色谱柱的选择 流动相的选择 样品前处理的新方法 色谱柱使用维护的建议,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题 1、分析物的物理、化学性质 样品基质-决定前处理方法 溶解性-决定正、反相方法 酸碱性-确定色谱柱类型、流动相组成 pKa-确定流动相的pH值 化学结构、特征官能团、Etc.

2、,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题 2、混合分析物的主要差异 疏水性差异-用疏水性选择性强的色谱柱 极性差异-用具有极性选择性的色谱柱 芳香性差异-用芳香选择性色谱柱 混合差异-用多种选择型色谱柱 分子量差异-GPC、GFC,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题 3、选用何种分析方法 HPLC-UV HPLC-IR HPLC-MS HPLC-ELSD Etc.,广州菲罗门科学仪器有

3、限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,色谱柱的选择 1、色谱柱的基本技术参数 固定相-决定选择性 硅胶纯度（金属含量）-影响峰形 粒径-影响柱效、柱压 碳载量-影响保留时间 孔径-孔径大，比表面积小 比表面积-影响载样量 pH范围-决定灵活性 封尾基团-影响峰形、保留,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,硅胶纯度（金属含量） Columns: A型硅胶 ( = 旧型号) B型硅胶 (Gemini 5m C18) Mobile phase:10mM 甲酸铵 p

4、H 3.5 : 乙腈: 甲醇（ 35:15:50 ） Flow rate:1.0 mL/min Components:1.Rhodamine 123 2. Rhodamine 6G 3. Rhodamine B Base 玫瑰精, 若丹明(一种红色荧光染料),广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,色谱图,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument

5、Co.,Ltd,A型硅胶C18 化合物被吸收 B型硅胶 （Gemini C18) 峰形、峰高、分离正常,金属的影响（1）,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,金属的影响（2）,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Phenomenex 典型B型硅胶色谱柱,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,2、疏水选择性色谱柱 -广泛应用于各类药物分析 经典C18-Luna

6、C18 Gemini C18(pH 112) 其他： C12、C8、C6、C5、C4,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Luna C18（2）-亚甲基选择性,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,世界#1色谱柱 （1）、反相方法开发的理想色谱柱 * 高纯硅胶基质，金属含量55.0ppm * 反相键合固定相pH稳定范围1.5-10,112 * 反相键合固定相TMS封尾，自由硅醇基极低 * 多种固定相可以选择,广州菲罗门科学仪器有限公司 G

7、uangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,（2）、GMP认证企业QC首选色谱柱 * 世界上首次具有MVD(Material Validation Document)证明文件的色谱柱 * 每支色谱柱都有唯一的检测证书，每支色谱柱都可以溯源 * 出色的柱-柱、批-批重现性,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,应用实例：注射用头孢唑林钠 色谱柱：Gemini C1

8、8 5u 250 x4.6mm 方法：ChP2005 图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,1.（1-唑基-1-）醋酸 2.头孢唑林烷酸水解物 3. 5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-巯基(MMTD) 4. 溶剂峰 7.未知杂质 8.头孢唑林 9.头孢唑林烷酸,应用实例：注射用氨苄西林钠相关物质检查 色谱柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm 方法：ChP2005 图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instr

9、ument Co.,Ltd,3、极性选择性色谱柱 代表：Synergi Polar-RP,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Columns: Luna 5m C18(2) YMC-Pack 5m Pro C18 Synergi 4m Polar-RP 150 x4.6mm Mobile phase:75:25 Methanol:water Flow rate:1 mL/min Components:1. Estrone(雌激素酮)2. Estradiol(雌二醇),广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou

10、FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,色谱图,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,4、芳香性选择性,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Columns: Luna 5m C18(2) 150 x4.6mm Luna5m Phenyl-Hexyl 150 x4.6mm Synergi 4mm P

11、olar-RP150 x4.6mm Mobile phase:50:50 Acetonitrile:20mM Potassium phosphate pH 2.5 Flow rate:1.0 mL/min Components:Acidic, aromatic compounds 1. Indoprofen 2. Ethyl paraben 3. Naproxen 4. Diflunisal5. Indomethacin 6. Ibuprofen,C18(2) Phenyl-Hexyl Polar-RP,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instru

12、ment Co.,Ltd,5、混合选择性 (1)强疏水性+强极性选择性 Synergi Hydro-RP column 推荐用于中药分析,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Synergi Hydro-RP,Synergi Max-RP（C12),Mobile Phase:A: 20mM KH2PO4, pH 4.6 B: Acetonitrile Gradient: A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 min Flow rate: 1.5 mL/min Sample:1. 吗啡 2.

13、氢吗啡酮 3. 可待因 4. 烯丙吗啡 5. 羟考酮,Synergi Hydro-RP,Synergi Hydro-RP VS. Luna C18(2) 2.苯丙醇胺 3.伪麻黄碱,Synergi Hydro-RP,5、混合选择性 （2）平衡极性、疏水性选择 Synergi Fusion-RP column 推荐用于药物代谢分析,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Running Conditions,Mobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: Acet

14、onitrile Flow rate: 1.5 ml/min Temperature: Ambient Detection: 210nm Injection: 1. 马来酸 2. 氯苯那敏 3.曲普利啶 4.本海拉明,Synergi Fusion-RP 4 80,一般的 C18柱,极性增大,疏水性减少,应用实例：注射用阿莫西林克拉维酸钾相关物质检查 色谱柱：Synergi Fusion-RP 250 x4.6mm 方法：ChP2005 图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,应用实例：头孢克洛

15、胶囊相关物质检查 色谱柱：Synergi Fusion-RP 250 x4.6mm 方法：ChP2005 图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,1.3-头孢克洛 2.头孢克洛,（3）、极性+芳香性 Synergi Polar-RP column （4）、芳香性+疏水性 Luna 苯基柱(pH 1.510) Gemini 苯基柱（pH 112),广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,流动相的选择 1、流动相的基本组成

16、 * 甲醇：洗脱能力较弱，压力较大；使用苯基柱时推荐使用。 * 乙腈：洗脱能力较强，压力较小；使用末端吸收时和梯度洗脱时推荐使用。 *梯度时：,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,2、流动相pH值的选择 酸性分析物：pHpKa-2 单一碱性分析物：pH3.5 或pHpKa+2 复杂碱性混合物：pHpKa+2,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrume

17、nt Co.,Ltd,Gemini C18 双子星柱 在pH 1-12范围内很稳定，可以更有弹性的选择流动相，因此，对酸、碱、中性化合物的分离都有很好的性能,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrume

18、nt Co.,Ltd,1.氯磺丙脲（pKa5.0) 2.对羟基苯甲酸丁酯 3.利多卡因（pKa 7.9) 4.苯丙烯啶（pKa6.5) 5.右甲吗南(pKa 9.2),广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,应用实例：苦参 色谱柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm 流动相：0.01M醋酸铵-乙腈（梯度） 图谱来源：北京市某研究所,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,样品前处理的新方法 在中药分析领域，SPE技术应用越来越广泛

19、。传统的SPE小柱如：C18、C8、硅胶、氧化铝等大多只能处理某一类物质，难以解决中药复杂成分的综合分析。 现在，同时把酸性化合物、碱性化合物和中性化合物分离，不再成为难题,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,-专为中药分析研发的SPE小柱- Strata X-C 小柱 机理：反相作用+阳离子交换 特点： 载样量更大，专属性更强，回收率更高，操作更简单。,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,Strata X-C 操作一般步骤 活化（MeOH） 平衡（H2O) *上样（中药提取液+酸溶液） 清洗1（酸性水溶液+适量甲醇） -收集可得酸性成分（黄酮、香豆素、大黄素等） 清洗2（MeOH) -收集可得中性成分 洗脱(碱性水溶液有机溶剂） -收集可得碱性成分（生物碱）,广州菲罗门科学仪器有限公司 Guangzhou FLM Scientific Instrument Co.,Ltd,色谱柱使用维护的建议 1、对相关物质检查分析，中药材分析，中成药分析，药物代谢分析必须使用保护柱。 原因： 保护柱作用：拦截死吸附的各类不明杂质，保护色谱柱，改善分离。,广州菲罗门科学仪器有限公司